专利名称：一种链霉菌培养基及其优化过程和应用方法
技术领域：
本发明涉及一种链霉菌培养基及其优化过程和应用方法。
背景技术：
链霉菌FR-008是梁蓉芳等在研究农抗5192产生菌原生质体融合育种的过程中发现的一株新的产生抗生素的链霉菌。其次及代谢产物FR-008，经过初步的化学结构分析表明FR-008和Candicidin(杀念菌素)化学结构是相同的。上海交通大学邓子新院士领衔的课题组在组合生物合成方面已经取得显著成绩，合成了一系列抗生素FR-008/Candicidin(杀念菌素)基因工程衍生化合物。其中包括糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101、酮糖转氨酶基因fscMII中断突变菌株CS102和细胞色素P450单氧化酶基因突变株CS103分别发酵培养得到的基因工程衍生物CS101、CS102和CS103。这些化合物中，有较强的抗真菌活性，且毒性较FR-008/Candicidin(杀念菌素)有明显降低，具有较高的临床开发前景。但是，这些基因工程抗生素的产量很低，制约了临床试验和产业化的进程，应用前景受到挑战。
培养基成分是影响抗生素发酵水平的关键因素，原始的培养基配方为葡萄糖1％，麦芽糖提取物0.3％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，灭菌前pH7.2-7.5。该配方不仅产量低，副产物较多，而且成本很高。因此，急需对培养基成份进行优化。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种链霉菌培养基及其优化过程和应用方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的培养基的组分和重量含量包括葡萄糖1～3％，淀粉1～3％，甘油1～3％，酵母粉0.1～0.5％工业氨基酸粉0.2～1％ 蛋白胨0.05～0.2％ NaCl 0.5～2％，FeSO4·7H2O0.01～0.1％，CuSO40.002～0.01％，以及余量的水；传统的优化方法使用单因子设计，需要进行大量的实验，并且结果不可靠。因此本发明将Plackett-Burman Design和Response SurfaceMethodology应用到FR-008/Candicidin(杀念菌素)及其系列基因工程衍生物发酵培养基的优化过程中，包括如下步骤首先根据Plackett-Burman Design，筛选出影响发酵水平的三个关键因素甘油、蛋白胨和CuSO4。其次是用Response Surface Methodology的方法，优化甘油、蛋白胨和CuSO4的最适培养浓度。我们首次发现铜离子在FR-008/Candicidin(杀念菌素)及其系列基因工程衍生物生物合成过程中，有明显的促进作用。
优化后的培养基配方，应用到FR-008/Candicidin(杀念菌素)及其系列基因工程衍生物的发酵培养过程，抗生素产量不同程度的提高了3-10倍。而且去除了成本较高的碳源——麦芽糖提取物，降低了成本较高的氮源——蛋白胨的含量，补充了廉价的氮源——工业氨基酸粉，使生产成本大幅降低，为后续制备临床试验样品和产业化奠定了坚实的基础。本发明与以往文献报道不同的是，首次发现CuSO4能够明显促进抗生素FR-008/Candicidin(杀念菌素)及其系列基因工程衍生物CS101、CS103等的合成。
本发明的目的之二在于公开上述培养基在基因工程抗生素发酵生产中的应用。
本发明的培养基制备方法包括如下步骤1.将葡萄糖、甘油、酵母粉、蛋白胨、NaCl加水溶解；2.在淀粉中加入淀粉重量的0.1～0.5％的淀粉酶，加热至70～85℃，静置10～20分钟，加热至沸腾；所说的淀粉酶购买于国药集团化学试剂有限公司，生产的牌号为SCRC 64003436，该酶为液化型淀粉酶，能够在高温(70～85℃)环境下将淀粉水解为糊精；3.将工业氨基酸粉，加热至溶液状，真空抽滤，除去杂质；4.将步骤1、2和3的产物混合，按照比例加水，灭菌；5.称取FeSO4·7H2O、CuSO4加50ml水溶解，加3ml浓度为1/4(v/v)的硫酸助溶，使溶液较澄清，用无菌过滤膜过滤.与步骤4的产物混合，用3～7mol/l的NaOH溶液调至6.90；本发明的培养基适应于抗生素FR-008/Candicidin(杀念菌素)及其系列基因工程衍生化合物。其中包括1)糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101培养得到的脱糖基的化合物CS101；2)酮糖转氨酶基因fscMII中断突变菌株CS102培养得到的脱氨糖的化合物CS102；3)细胞色素P450单氧化酶基因突变株CS103培养得到的毒性降低的化合物CS103；4)抗生素FR-008/Candicidin(杀念菌素)；5)其他的通过组合生物合成技术得到的FR-008/Candicidin(杀念菌素)的基因工程衍生物。
本发明的培养基，它既能满足摇瓶实验的需要，又能成功的将摇瓶发酵结果放大到发酵罐，而且副产物减少，利于下游的分离纯化工作。该培养基配方和优化以前的培养基相比，抗生素产量不同程度的提高了3-10倍，而且生产成本大幅降低。
具体实施例方式
实施例11.按照葡萄糖2％，甘油1.389％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.101％，NaCl 1％，FeSO4·7H2O 0.05％，CuSO40.00428％的比例称取培养基各组分适量(淀粉和工业氨基酸粉除外)，加适量去离子水溶解。
2.按照0.2％的比例称取适量淀粉，加入少量淀粉酶，加热至80摄氏度左右，放置15分钟，再加热至沸腾，此时溶液成透明并略带荧光装。
3.按照0.5％的比例称适量工业氨基酸粉，加热至溶液状，此时颜色会稍深，但含不溶性固体，真空抽滤3～4遍除去杂质。
4.将上述成分放在同一烧杯中，再加水定容，放入反应器中灭菌。
5.称取FeSO4·7H2O、CuSO4加50ml水溶解，加3ml浓度为1/4(v/v)的硫酸助溶，使溶液较澄清，用无菌过滤膜过滤.后加入反应器中，调节pH至6.90，即获得所说的培养基。
实施例2使用上述培养基，发酵培养以下菌株1)糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101；2)细胞色素P450单氧化酶基因突变株CS103；3)抗生素FR-008/Candicidin(杀念菌素)。
培养基成分
葡萄糖2％淀粉1％甘油1.389％酵母粉0.3％工业氨基酸粉0.5％蛋白胨0.101％NaCl 1％FeSO4·7H2O 0.05％CuSO40.00428％灭菌前，pH使用5mol/l的NaOH溶液调到6.90。
培养方法接种时间为30小时，接种量10％，28度摇床，200rpm培养，放瓶检测抗生素CS101、CS103和FR-008/Candicidin的发酵水平分别为216mg/l、40mg/l和252mg/l。
对比实施例1使用原始培养基，培养以下菌株1)糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101；2)细胞色素P450单氧化酶基因突变株CS103；3)抗生素FR-008/Candicidin(杀念菌素)。
培养基成分葡萄糖1％，麦芽糖提取物0.3％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，灭菌前pH7.0-7.5。培养方法接种时间为30小时，接种量10％，28度摇床，200rpm培养，放瓶检测抗生素CS101、CS103和FR-008/Candicidin的发酵水平分别为18mg/l、9mg/l和52mg/l。
对比实施例2使用不加铜离子的培养基，培养以下菌株1)糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101；2)细胞色素P450单氧化酶基因突变株CS103。
培养基成分葡萄糖2％淀粉1％甘油1.389％酵母粉0.3％工业氨基酸粉0.5％蛋白胨0.101％NaCl 1％FeSO4·7H2O 0.05％
灭菌前，pH使用5mol/l的NaOH溶液调到6.90。
培养方法接种时间为30小时，接种量10％，28度摇床，200rpm培养，放瓶检测抗生素CS101和CS103的发酵水平分别为111mg/l和29mg/l。
权利要求
1.一种链霉菌培养基，其特征在于，组分和重量含量包括葡萄糖1～3％，淀粉1～3％，甘油1～3％，酵母粉0.1～0.5％工业氨基酸粉0.2～1％蛋白胨0.05～0.2％NaCl 0.5～2％，FeSO4·7H2O0.01～0.1％，CuSO40.002～0.01％，以及余量的水。
2.根据权利要求1所述的链霉菌培养基的优化方法，其特征在于，包括如下步骤首先根据Plackett-Burman Design，筛选出影响发酵水平的三个关键因素甘油、蛋白胨和CuSO4。其次是用Response Surface Methodology的方法，优化甘油、蛋白胨和CuSO4的最适培养浓度。
3.根据权利要求1所述的链霉菌培养基的培养基制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1).将葡萄糖、甘油、酵母粉、蛋白胨、NaCl加水溶解；(2)在淀粉中加入淀粉重量的0.1～0.5％的淀粉酶，加热至70～85℃，静置10～20分钟，加热至沸腾；(3)将工业氨基酸粉，加热至溶液状，真空抽滤，除去杂质；(4)将步骤1、2和3的产物混合，按照比例加水，灭菌；(5)称取FeSO4.7H2O、CuSO4加50ml水溶解，加3ml浓度为1/4(v/v)的硫酸助溶，使溶液较澄清，用无菌过滤膜过滤.与步骤4的产物混合，用3～7mol/l的NaOH溶液调至6.90。
4.权利要求1所述的链霉菌培养基在基因工程抗生素发酵生产中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所说的基因工程抗生素包括抗生素FR-008/Candicidin(杀念菌素)及其系列基因工程衍生化合物，其中包括1)糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101培养得到的脱糖基的化合物CS101；2)酮糖转氨酶基因fscMII中断突变菌株CS102培养得到的脱氨糖的化合物CS102；3)细胞色素P450单氧化酶基因突变株CS103培养得到的毒性降低的化合物CS103；4)抗生素FR-008/Candicidin(杀念菌素)；5)其他的通过组合生物合成技术得到的FR-008/Candicidin(杀念菌素)的基因工程衍生物。
全文摘要
本发明涉及一种链霉菌培养基及其优化过程和应用方法，组分和重量含量包括葡萄糖1～3％，淀粉1～3％，甘油1～3％，酵母粉0.1～0.5％，工业氨基酸粉 0.2～1％蛋白胨0.05～0.2％NaCl 0.5～2％，FeSO
文档编号C12P1/04GK1844358SQ20061002571
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月14日 优先权日2006年4月14日
发明者沈亚领, 魏东芝, 毛相朝, 杨亮, 邓子新, 陈实 申请人:华东理工大学, 上海交通大学