专利名称：圈卷产色链霉菌变株及其培养方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，特指一种圈卷产色链霉菌变株及其培养方法和应用。
圈卷产色链霉菌为中国科学院微生物研究所筛选培养出的放线菌，可用其产生新多氧霉素菌，该菌在放线菌分类上属于链霉菌属，命名为圈卷产色链霉菌种(Streptomyces ansochromogenus)。其培养和发酵方法包括如下步骤1、斜面培养基用高氏一号培养基或葡萄糖-天门冬素做培养基，装斜面培养基于试管内。
2、斜面培养用从自然界土壤中分离出的链霉菌接种到斜面培养基后，在20-30℃条件下培养，便获得该菌种的斜面培养物；3、发酵培养液配制用黄豆粉1.0-5.0％、淀粉0.8％-5.5％、NaCl 0.1-0.8％、酵母浸膏0.05-0.35％、碳酸钙0.15-0.4％，与水混匀，分装于三角瓶，高压灭菌，121℃，30分钟，制成发酵培养液；4、培养圈卷产色链霉菌将3-8ml的无菌生理盐水加入培养好的斜面中，用接种环刮取斜面上已长好的菌苔，制成菌悬液，取0.1-1.0ml菌悬液接入发酵培养液中，5瓶/批，在20-32℃的条件下摇瓶培养30-75小时，摇瓶机的转速为120-300转/分，偏心距为15mm-30mm，培养出圈卷产色链霉菌。其主要缺陷在于产素能力较低，且产素的不稳定性较高，同一批中，不同三角瓶的产素水平的差距在30-60％之间，不同批的平均产素水平偏差也在30％以上，故难以应用于实际生产中。
本发明的目的在于提供一种圈卷产色链霉菌变株及其培养方法和应用，通过物理或化学诱变处理孢子液来改变其产素不稳定性，达到提高产素能力及培养高产稳定的圈卷产色链霉菌变株的目的。
本发明的目的是这样实现的一种圈卷产色链霉菌变株，通过化学诱变剂、紫外线照射、卫星搭载和高能等离子辐射复合处理中的一种或两种以上联合处理孢子液，培养出的圈卷产色链霉素菌变株，保藏号为CGMCC NO0446，分类命名为“圈卷产色链霉菌种Streptomyces ansochromogenus”；该化学诱变剂为N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍，使用浓度为120微克-300微克，该紫外线诱变处理为在紫外灯下照射30-300秒，避光进行紫外线诱变处理；该卫星搭载和高能等离子辐射复合处理为先将孢子液置于安培管及微生物培养箱内，在卫星搭载舱内随卫星搭载，再置于高能等离子发生器内进行辐射诱变处理5-90秒钟。
一种圈卷产色链霉菌变株的培养方法，具体步骤如下(1)孢子液的制备先将链霉菌的菌种接种到斜面培养基中，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，装斜面培养基的试管规格内径为14-22mm，长度为18-23mm，试管的盖为棉塞或硅橡胶塞，培养温度为20-32℃，时间5-35天，待菌苔生长出后，加入5-12ml/支的无菌生理盐水，将菌苔轻轻刮起，使菌苔表面的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至的三角瓶中；(2)诱变处理通过化学诱变剂、紫外线照射、卫星搭载和高能等离子辐射复合处理中的一种或两种以上联合处理孢子液，培养出的、圈卷产色链霉素菌变株。
(3)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为20-35℃，时间5-40天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株。
该化学诱变剂处理为在制备的孢子液中，加化学诱变剂N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍，浓度为120微克-300微克，在温度20-38℃条件下，上摇瓶机，转速15-60转/分，避光进行化学诱变处理，时间为20分钟至90分钟。
该紫外线诱变处理为，将制备好的孢子液加到内径为4-10mm的双碟中，加入量为3-15ml，在距离为250mm-600mm的紫外灯下，照射时间为30-200秒，处理前、后及处理过程中，均要求避免其他光线进行紫外线诱变处理。
该卫星搭载和高能等离子辐射复合处理为先将孢子液置于安培管及微生物培养箱内，在卫星搭载舱内随卫星搭载10-20天，再置于高能等离子发生器内进行辐射诱变处理5-90秒钟。
一种圈卷产色链霉菌变株的应用，圈卷产色链霉菌变株应用于工业化微生物发酶生产新多氧霉素及新多氧霉素衍生物的前体生产中。
本发明的主要优点是通过物理或化学诱变处理孢子液来改变其产素不稳定性，具有培养高产稳定的圈卷产色链霉菌变株的功效，其产素能力提高12-80％，产素瓶差由30-60％降为30％以下，不同批的平均产素水平偏差由30％以上降为30％以下。可应用于工业化微生物发酵生产新多氧霉素及与新多氧霉素有关的衍生物的前体生产中。
下面结合较佳实施例进一步说明。
实施例1本发明是通过化学诱变剂、紫外线照射、卫星搭载和高能等离子辐射复合处理中的一种或两种以上联合处理孢子液，培养出的圈卷产色链霉素菌变株，保藏号为CGMCC NO0446，分类命名为“圈卷产色链霉菌种(Streptomycesansochromogenus)”。
该化学诱变剂为N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍，使用浓度为120微克-300微克，该紫外线诱变处理为在紫外灯下照射30-300秒，避光进行紫外线诱变处理；该卫星搭载和高能等离子辐射复合处理为先将孢子液置于安培管及微生物培养箱内，在卫星搭载舱内随卫星搭载，再置于高能等离子发生器内进行辐射诱变处理5-90秒钟。
本发明的第一种诱变方法是化学诱变剂处理采用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(简称NTG，以下同)做化学诱变剂处理链霉菌菌种。
具体步骤如下(1)孢子液的制备先将链霉菌的菌种接种到斜面培养基中，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，装斜面培养基的试管规格内径为14-22mm，长度为18-23mm，试管的盖为棉塞或硅橡胶塞，培养温度为20-32℃，时间5-35天，待菌苔生长出后，加入5-12ml/支的无菌生理盐水，将菌苔轻轻刮起，使菌苔表面的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的总体积5-20ml；高氏一号培养基的配方为可溶性淀粉20.0克、KNO31.0克、K2HPO40.5克、MgSO4.7H2O 0.5克、NaCl 0.5克、FeSO4.7H2OO 0.01克、琼脂15克、蒸馏水1.0升、pH7.2-7.4。葡萄糖-天门冬素培养基的配方为葡萄糖10.0克、天门冬素0.5克、K2HPO40.5克、琼脂15.0克、蒸馏水1.0升、pH7.2-7.4；(2)化学诱变处理加化学诱变剂N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍，终浓度为120微克-300微克，在温度20-38℃条件下，上摇瓶机，转速15-60转/分，避光进行化学诱变处理，时间20分钟至90分钟；(3)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为20-35℃，时间5-40天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株；产素性能比较调取本发明制取的单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同上述(1)孢子液的制备，原有的链霉菌菌株同时进行，也按上述(1)孢子液的制备操作。取孢子悬液0.15-1.0ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的容器为500ml三角瓶，装量为40-100ml，进行摇瓶培养。共做6批的结果表明，本发明的化学诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为20-30％，不同批的平均水平偏差为22-28％；整体产素水平本发明的化学诱变株要比对照株提高12-18％。
实施例2本发明的第二种诱变方法是紫外线照射处理。具体培养步骤如下(1)孢子液的制备同实施例1的(1)孢子液的制备。
(2)紫外线诱变处理将制备好的孢子液加到内径为4-10mm的双碟中，加入量为3-15ml，在距离为250mm-600mm的紫外灯下，照射时间为30-200秒，处理前、后及处理过程中，均要求避免其他光线进行紫外线诱变处理。
(3)分离诱变株同实施例1的(3)分离诱变株。
产素性能比较调取本方法制取的变株单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1的(1)孢子液的制备，原有菌株同时进行，也按实施例1的(1)孢子液的制备操作。各取孢子悬液0.15-1.0ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的容器为500ml三角瓶，装量为40-100ml，进行摇瓶培养。共做5批的结果表明，紫外线诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为12-30％，不同批的平均水平偏差为25-30％；整体产素水平本发明的紫外线诱变株要比对照株提高15-26％。
实施例3本发明的第三种诱变方法是卫星搭载和高能等离子辐射复合处理，具体培养步骤如下(1)孢子液的制备同实施例1的(1)孢子液的制备或(2)化学诱变处理；(2)卫星搭载处理将孢子液分装于安培管内，装入微生物样品盒内，再装入微生物培养箱内，最后置放在卫星搭载舱内，常温或控温搭载均可，卫星回收后制得卫星搭载样品；(3)高能等离子体辐射处理按实施例1的(1)孢子液的制备操作，然后将制备的孢子液装入内径为8-10mm的双碟中，装量为5-20ml，置于高能等离子发生器进行辐射诱变处理，辐射时间5-90秒，温度为常温；(4)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为20-35℃，时间5-40天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取本发明制取的单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同上述(1)孢子液的制备，原有的链霉菌菌株同时进行，也按上述(1)孢子液的制备操作。取孢子悬液0.15-1.0ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的容器为500ml三角瓶，装量为40-100ml，进行摇瓶培养。共做4批的结果表明，产素瓶差为12-20％，不同批的平均水平偏差为18-25％；整体产素水平诱变株要比对照株提高12-25％。
实施例4本实施例采用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(简称NTG，以下同)做化学诱变剂处理菌种。具体步骤如下(1)孢子液的制备先将链霉菌菌种接种到斜面培养基中，培养基为高氏一号培养基，装斜面培养基的试管规格内径为14mm，长度为18mm，试管的盖为硅橡胶塞，培养温度为21℃，时间6天，待菌苔生长好后，加入6ml/支的无菌生理盐水，用竹铲将菌苔轻轻刮起，使菌苔表面的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的总体积6ml，孢子数在104-105/ml；(2)诱变处理加诱变剂NTG，终浓度为125微克-130微克，温度21℃，上摇瓶机，转速16-20转/分，避光，时间22分钟；(3)分离诱变株取处理后的菌液0.06ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号培养基，用直径为3mm玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，然后进行培养，温度为21℃，时间6天，培养出本发明的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1的(1)孢子液的制备，原有菌株同时进行，也按实施例1的(1)孢子液的制备操作。取孢子悬液0.2-0.4ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的容器为500ml三角瓶，装量为40-45ml，进行摇瓶培养。共进行了3批的测试。结果为，诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为28-30％，不同批的平均水平偏差为22-24％；整体产素水平诱变株要比对照株提高12-13％。
实施例5本实施例采用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(简称NTG，以下同)做化学诱变剂处理菌种。具体步骤如下(1)孢子液的制备先将链霉菌菌种接种到斜面培养基中，葡萄糖-天门冬素培养基，装斜面培养基的试管规格内径为15mm，长度为19mm，试管的盖为硅橡胶塞，培养温度为25℃，时间23天，待菌苔生长好后，加入8ml/支的无菌生理盐水，用接种环将菌苔轻轻刮起，使菌苔表面的的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的总体积10ml，孢子数在104-105/ml；(2)诱变处理加诱变剂NTG，终浓度为135微克-140微克，温度25℃，上摇瓶机，转速16-20转/分，避光，时间30分钟；(3)分离诱变株取处理后的菌液0.08ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为葡萄糖-天门冬素培养基，用直径为3mm玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，然后进行培养，温度为25℃，时间23天，培养出本发明的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1，原有菌株同时进行，也按实施例1操作。取孢子悬液0.2-0.4ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的的容器为500ml三角瓶，装量为40-45ml，进行摇瓶培养。共进行了3批的观察。结果，诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为22-30％，不同批的平均水平偏差为23-25％；整体产素水平诱变株要比对照株提高13-15％。
实施例6本实施例采用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(简称NTG，以下同)做化学诱变剂处理菌种。具体步骤如下(1)孢子液的制备先将菌种接种到斜面培养基中，培养基为高氏一号，装斜面培养基的试管规格内径为22mm，长度为23mm，试管的盖为棉塞，培养温度为27℃，时间20天，待菌苔生长好后，加入7ml/支的无菌生理盐水，用钢铲将菌苔轻轻刮起，使菌苔表面的的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的总体积20ml，孢子数在105-108/ml；(2)诱变处理加诱变剂NTG，终浓度为150微克-155微克，温度27℃，上摇瓶机，转速21-25转/分，避光，时间35分钟；(3)分离诱变株取处理后的菌液0.3ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号培养基，用直径为5mm玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，然后进行培养，温度为27℃，时间8天培养出本发明的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1，原有菌株同时进行，也按实施例1操作。取孢子悬液0.5ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的的容器为500ml三角瓶，装量为50ml，进行摇瓶培养。共进行了4批的观察。结果，诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为28-30％，不同批的平均水平偏差为26-28％；整体产素水平诱变株要比对照株提高16-18％。
实施例7本实施例采用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(简称NTG，以下同)做化学诱变剂处理菌种。具体步骤如下(1)孢子液的制备先将链霉菌菌种接种到斜面培养基中，培养基为高氏一号，装斜面培养基的试管规格内径为14mm，长度为18mm，试管的盖为棉塞，培养温度为28℃，时间11天，待菌苔生长好后，加入7ml/支的无菌生理盐水，用试管吹吸4遍，使菌苔表面的的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的总体积5ml，孢子数在105-108/ml；(2)诱变处理加诱变剂NTG，终浓度为155微克-165微克，温度28℃，上摇瓶机，转速21转/分，避光，时间38分钟；(3)分离诱变株取处理后的菌液0.35ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为葡萄糖-天门冬素培养基，用直径为5mm玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，然后进行培养，温度为28℃，时间9天，培养出本发明的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1，原有菌株同时进行，也按实施例1操作。取孢子悬液0.5-0.6ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的的容器为500ml三角瓶，装量为45-50ml，进行摇瓶培养。共进行了5批的观察。结果，诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为20-30％，不同批的平均水平偏差为24-28％；整体产素水平诱变株要比对照株提高14-16％。
实施例8本实施例采用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(简称NTG，以下同)做化学诱变剂处理菌种。具体步骤如下(1)孢子液的制备先将菌种接种到斜面培养基中，培养基为葡萄糖-天门冬素培养基，装斜面培养基的试管规格内径为15mm，长度为20mm，试管的盖为棉塞，培养温度为30℃，时间12天，待菌苔生长好后，加入8ml/支的无菌生理盐水，用试管吹吸5遍，使菌苔表面的的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的总体积10ml，孢子数在109-1010/ml；(2)诱变处理加诱变剂NTG，终浓度为180微克-190微克，温度35℃，上摇瓶机，转速26-35转/分，避光，时间70分钟；(3)分离诱变株取处理后的菌液0.45ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号培养基，用直径为3mm玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，然后进行培养，温度为27℃，时间12天培养出本发明的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1，原有菌株同时进行，也按实施例1操作。取孢子悬液0.5-0.6ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的的容器为500ml三角瓶，装量为45-50ml，进行摇瓶培养。共进行了5批的观察。结果，诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为23-30％，不同批的平均水平偏差为24-28％；整体产素水平诱变株要比对照株提高14-18％。
实施例9本实施例的诱变处理方法为紫外线照射处理。具体步骤如下(1)孢子液的制备先将菌种接种到斜面培养基中，培养基为高氏一号培养基，装斜面培养基的试管规格内径为16mm，长度为18.5mm，试管的盖为硅橡胶塞，培养温度为29℃，时间15天，待菌苔生长好后，加入10ml/支的无菌生理盐水，用竹铲将菌苔轻轻刮起，使菌苔表面的的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至50ml的三角瓶中，孢子液的总体积20ml，孢子数在106-108/ml；(2)将制备好的孢子液加到内径为9mm的双碟中，加入量为5ml，在紫外灯下，距离为250mm，照射时间为50秒，处理前、后及处理过程中，均要求避免其他光线。培养出本发明的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1，原有菌株同时进行，也按实施例1操作。取孢子悬液0.2-0.3ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的的容器为500ml三角瓶，装量为45-50ml，进行摇瓶培养。共进行了4批的观察。结果，诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为28-30％，不同批的平均水平偏差为26-28％；整体产素水平诱变株要比对照株提高15-18％。
实施例10
本实施例的诱变处理方法为紫外线照射处理。具体步骤如下(1)孢子液的制备先将菌种接种到斜面培养基中，培养基为葡萄糖-天门冬素培养基，装斜面培养基的试管规格内径为19mm，长度为21mm，试管的盖为棉塞，培养温度为27℃，时间12天，待菌苔生长好后，加入7ml/支的无菌生理盐水，用试管吹吸5遍，使菌苔表面的的孢子尽可能地分散到盐水中；(2)将制备好的孢子液加到内径为6mm的双碟，加入量为5ml，孢子数在1010-1012/ml，在紫外灯下，距离为300mm，照射时间为65秒，处理前、后及处理过程中，均要求避免其他光线，培养出本发明的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1，原有菌株同时进行，也按实施例1操作。取孢子悬液0.8-1.0ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的的容器为500ml三角瓶，装量为55-60ml，进行摇瓶培养。共进行了5批的观察。结果，诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为22-28％，不同批的平均水平偏差为27-29％；整体产素水平诱变株要比对照株提高19-22％。
实施例11本实施例的诱变处理方法为紫外线照射处理。具体步骤如下(1)孢子液的制备先将菌种接种到斜面培养基中，培养基为葡萄糖-天门冬素培养基，装斜面培养基的试管规格内径为20mm，长度为21mm，试管的盖为硅橡胶塞，培养温度为30℃，时间12天，待菌苔生长好后，加入8ml/支的无菌生理盐水，用试管吹吸4遍，使菌苔表面的的孢子尽可能地分散到盐水中；(2)将制备好的孢子液加到内径为4mm的双碟，加入量为3ml，孢子数在1010-1012/ml，在紫外灯下，距离为400mm，照射时间为90秒，处理前、后及处理过程中，均要求避免其他光线，培养出本发明的圈卷产色链霉菌变株。
产素性能比较调取单菌落接种到斜面培养基中，培养条件同实施例1，原有菌株同时进行，也按实施例1操作。取孢子悬液0.8-1.0ml/瓶，5瓶/批，接种到液体培养基中，液体培养基的的容器为500ml三角瓶，装量为55-60ml，进行摇瓶培养。共进行了5批的观察。结果，诱变株同批摇瓶个体比较，产素水平偏差为12-20％，不同批的平均水平偏差为25-28％；整体产素水平诱变株要比对照株提高23-25％。
实施例12本实施例的诱变处理方法为卫星搭载和高能等离子辐射复合处理。具体步骤如下(1)孢子液的制备同实施例1的(1)孢子液的制备；(2)卫星搭载处理将孢子液分装于安培管内，装入微生物样品盒内，再装入微生物培养箱内，最后置放在卫星搭载舱内，常温搭载，搭载时间10天，卫星回收后得搭载样品，(3)高能等离子体辐射处理按实施例1的(1)孢子液的制备操作，然后将制备的孢子液装入内径为10mm的双碟中，装量为5ml，置于高能等离子发生器进行辐射诱变处理，辐射时间9秒，温度为常温；(4)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为20℃，时间40天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株。共进行了3批的观察。对照株为链霉菌。结果，产素瓶差为13-20％，不同批的平均水平偏差为19-21％；整体产素水平诱变株要比对照株提高13-15％。
实施例13本实施例的诱变处理方法为化学诱变处理与卫星搭载和高能等离子辐射复合处理的联合处理。具体步骤如下(1)孢子液的制备孢子液的来源为实施例7的孢子液；(2)卫星搭载处理将孢子液分装于安培管内，装入微生物样品盒内，再装入微生物培养箱内，最后置放在卫星搭载舱内，常温搭载，搭载时间10天，卫星回收后待搭载样品；(3)高能等离子体辐射处理按实施例1的(1)孢子液的制备操作，然后将制备的孢子液装入内径为10mm的双碟中，装量为10ml，置于高能等离子发生器进行辐射诱变处理，辐射时间10秒，温度为常温；(4)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为35℃，时间5天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株。共进行了4批的观察。对照株为化学诱变剂处理的变株。结果，产素瓶差为18-22％，不同批的平均水平偏差为20-23％；整体产素水平诱变株要比对照株提高15-18％。总产素水平提高为实施例7与本实施例相加，即(14-16％)+(15-18％)，合计为29-34％。
实施例14本实施例的诱变处理方法为化学诱变处理与卫星搭载和高能等离子辐射复合处理的联合处理。具体步骤如下(1)孢子液的制备孢子液的来源为实施例8的孢子液；(2)卫星搭载处理将孢子液分装于安培管内，装入微生物样品盒内，再装入微生物培养箱内，最后置放在卫星搭载舱内，恒温搭载，温度为25℃，搭载时间15天，卫星回收后待搭载样品；(3)高能等离子体辐射处理按实施例1的(1)孢子液的制备操作，然后将制备的孢子液装入内径为9mm的双碟中，装量为7ml，置于高能等离子发生器进行辐射诱变处理，辐射时间15秒，温度为常温；(4)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为20-35℃，时间5-40天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株。共进行了4批的观察。对照株为化学诱变剂处理的变株(见实施例8)。结果，产素瓶差为18-20％，不同批的平均水平偏差为18-20％；整体产素水平诱变株要比对照株提高18-20％。总产素水平提高为33-38％。
实施例15本实施例的诱变处理方法为化学诱变处理与卫星搭载和高能等离子辐射复合处理的联合处理。具体步骤如下(1)孢子液的制备孢子液的来源为实施例4的孢子液；(2)卫星搭载处理将孢子液分装于安培管内，装入微生物样品盒内，再装入微生物培养箱内，最后置放在卫星搭载舱内，常温搭载，搭载时间15天，卫星回收后得搭载样品；(3)高能等离子体辐射处理按实施例1的(1)孢子液的制备操作，然后将制备的孢子液装入内径为6mm的双碟中，装量为8ml，置于高能等离子发生器进行辐射诱变处理，辐射时间16秒，温度为常温；(4)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为20℃，时间40天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株。共进行了4批的观察。对照株为化学诱变剂处理的变株(见实施例4)。结果，产素瓶差为14-19％，不同批的平均水平偏差为20-23％；整体产素水平诱变株要比对照株提高21-23％。总产素水平提高为33-36％。
实施例16本实施例的诱变处理方法为紫外线照射处理与卫星搭载和高能等离子辐射复合处理的联合处理。具体步骤如下(1)孢子液的制备孢子液的来源为实施例11的孢子液；(2)卫星搭载和高能等离子辐射复合处理将孢子液分装于安培管内，装入微生物样品盒内，再装入微生物培养箱内，最后置放在卫星搭载舱内，常温搭载，搭载时间20天，卫星回收后待搭载样品；(3)高能等离子体辐射处理按实施例1的(1)孢子液的制备操作，然后将制备的孢子液装入内径为10mm的双碟中，装量为20ml，置于高能等离子发生器进行辐射诱变处理，辐射时间40秒，温度为常温；(4)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为35℃，时间5天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株。共进行了4批的观察。对照株为紫外线照射诱变处理的变株(见实施例11)。结果，产素瓶差为11-18％，不同批的平均水平偏差为10-15％；整体产素水平诱变株要比对照株提高20-25％。总产素水平提高为43-50％。
当然还可以将各诱变处理后的孢子液进一步再进行诱变处理，如此得到更高的总产素水平，因处理方法相同，故不重述。
上述实施例1-16的诱变处理条件及产素水平列于表1
表1中I为化学诱变处理II为紫外线诱变处理；
III为卫星搭载和高能等离子辐射复合处理；III1为实施例7的化学诱变孢子液与III联合处理III2为实施例8的化学诱变孢子液与III联合处理III3为实施例4的化学诱变孢子液与III联合处理III4为实施例11的紫外线诱变孢子液与III联合处理。
从表1的实施结果表明，本发明的诱变处理方法中的一种或两种以上的联合处理后，其产素的瓶差在30％以下，批差在30％以下，整体产素水平提高12-26％，其两种或两种以上的联合诱变处理，产素水平提高量为两次或两次以上的加和，故总产素水平可达12-80％。克服了现有技术中产素能力较低及产素的不稳定性较高的缺陷，从而开创了将圈卷产色链霉菌变株应用于工业化微生物发酶生产新多氧霉素及新多氧霉素衍生物的前体生产中的新途径。
新多氧霉素能够抑制多种真菌的生长，可用于防治多种农作物的真菌病害，如苹果斑点落叶病，防治有效率达68％，使用浓度为150ppm。草莓灰霉病，防治有效率达99％，使用浓度为200ppm。人参褐斑病，防治有效率达79％，使用浓度为160ppm。烟草赤星病，防治有效率达76％，使用浓度为150ppm。
圈卷产色链霉菌变株与原有菌株的区别表现为产素性能稳定性的差别及菌株全旦白分析上的差别，主要特征原有菌株缺少分子量为66000道尔顿、45000道尔顿、34700道尔顿的蛋白带；原有菌株与变株的蛋白带分布差别较大的分子量是在24000-66000道尔顿之间，最为明显的是前沿蛋白带的区别。
权利要求
1.一种圈卷产色链霉菌变株，其特征在于通过化学诱变剂、紫外线照射、卫星搭载和高能等离子辐射复合处理中的一种或两种以上联合处理孢子液，培养出的圈卷产色链霉素菌变株，保藏号为CGMCC NO0446，分类命名为“圈卷产色链霉菌种Streptomyces ansochromogenus”。
2.如权利要求1所述的圈卷产色链霉菌变株，其特征在于该化学诱变剂为N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍，使用浓度为120微克-300微克；
3.如权利要求1所述的圈卷产色链霉菌变株，其特征在于该紫外线诱变处理为在紫外灯下照射30-300秒，避光进行紫外线诱变处理；
4.如权利要求1所述的圈卷产色链霉菌变株，其特征在于该卫星搭载和高能等离子辐射复合处理为先将孢子液置于安培管及微生物培养箱内，在卫星搭载舱内随卫星搭载，再置于高能等离子发生器内进行辐射诱变处理5-90秒钟。
5.一种圈卷产色链霉菌变株的培养方法，其特征在于具体步骤如下(1)孢子液的制备先将链霉菌的菌种接种到斜面培养基中，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，装斜面培养基的试管规格内径为14-22mm，长度为18-23mm，试管的盖为棉塞或硅橡胶塞，培养温度为20-32℃，时间5-35天，待菌苔生长出后，加入5-12ml/支的无菌生理盐水，将菌苔轻轻刮起，使菌苔表面的孢子尽可能地分散到盐水中，用吸管将孢子液移至的三角瓶中；(2)诱变处理通过化学诱变剂、紫外线照射、卫星搭载和高能等离子辐射复合处理中的一种或两种以上联合处理孢子液，培养出圈卷产色链霉素菌变株；(3)分离诱变株取处理后的菌液0.05-0.5ml/皿加到事先铺好的平板，培养基为高氏一号或葡萄糖-天门冬素培养基，用玻璃棒制成的三角刮铲涂平板，进行培养，温度为20-35℃，时间5-40天，培养出本发明的高产稳定的圈卷产色链霉菌变株。
6.如权利要求5所述的圈卷产色链霉菌变株的培养方法，其特征在于该化学诱变剂处理为在制备的孢子液中，加化学诱变剂N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍，终浓度为120微克-300微克，在温度20-38℃条件下，上摇瓶机，转速15-60转/分，避光进行化学诱变处理，时间为20分钟至90分钟。
7.如权利要求5所述的圈卷产色链霉菌变株的培养方法，其特征在于该紫外线诱变处理为，将制备好的孢子液加到内径为4-10mm的双碟中，加入量为3-15ml，在距离为250mm-600mm的紫外灯下，照射时间为30-200秒，处理前、后及处理过程中，均要求避免其他光线进行紫外线诱变处理。
8.如权利要求5所述的圈卷产色链霉菌变株的培养方法，其特征在于该卫星搭载和高能等离子辐射复合处理为先将孢子液置于安培管及微生物培养箱内，在卫星搭载舱内随卫星搭载，再置于高能等离子发生器内进行辐射诱变处理5-90秒钟。
9.一种圈卷产色链霉菌变株的应用，其特征在于圈卷产色链霉菌变株应用于工业化微生物发酶生产新多氧霉素及新多氧霉素衍生物的前体生产中。
全文摘要
一种圈卷产色链霉菌变株及其培养方法和应用,通过化学诱变剂、紫外线照射、卫星搭载和高能等离子辐射复合处理中的一种或两种以上联合处理孢子液,培养出圈卷产色链霉素菌变株,保藏号为CGMCC NO0446,分类命名为“圈卷产色链霉菌种Streptomyces ansochromogenus”。圈卷产色链霉菌变株应用于工业化微生物发酶生产新多氧霉素及新多氧霉素衍生物的前体生产中。
文档编号C12N13/00GK1269404SQ0010588
公开日2000年10月11日 申请日期2000年4月14日 优先权日2000年4月14日
发明者骆爱群, 宋幼新, 刘志恒 申请人:中国科学院微生物研究所