厦门链霉菌在作为斑鸠霉素新产生菌中的用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物医药技术领域的抗肿瘤活性天然产物斑鸠霉素的产生菌，具体涉及一种厦门链霉菌在作为斑鸠霉素新产生菌中的用途及发酵产物中斑鸠霉素的快速提取方法。
【背景技术】
[0002]斑鸠霉素，ikarugamycin,是于1972年由K.Jomon等人发现从土壤放线菌Streptomyces sp.N0.8603中发现的一种多环稠合的大环内酰胺类抗生素，属于多环teramate大环内酰胺(PTM)家族。
[0003]后期研究发现，斑鸠霉素具有多种活性，包括抗原生动物(antiprotozoal)，抗溃疡(antiulcer)，抗菌(antibacterial),抗病毒(antiviral),细胞毒(cytotoxic),诱导凋亡(apoptosis inducing)活性等。在抗肿瘤机理研究过程中发现，该化合物能够激活caspase家族，导致DNA损伤，提升细胞间钙离子水平并激活p38MAP激酶从而诱导肿瘤细胞凋亡。因此，斑鸠霉素是抗肿瘤药物先导化合物。
[0004]斑鸠霉素具有5-6-5三环系统及17元大环的结构，其生物合成基因簇包括三个关键基因:杂合的聚酮/非核糖体聚肽合成酶基因ikaA、FAD依赖的氧化还原酶基因ikaB、以及类似Michael环化反应没基因ikaC。因此斑鸠霉素的生物合成基因簇，为表征该类化合物的生物合成能力提供了依据。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种厦门链霉菌在作为斑鸠霉素新产生菌中的用途及发酵产物中斑鸠霉素的快速提取方法。
[0006]本发明中，所述厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)已于2011年12月29日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC N0.5675。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0008]本发明涉及一种厦门链霉菌在用作斑鸠霉素新产生菌中的用途，即在制备斑鸠霉素及其衍生物中的用途，所述厦门链霉菌为厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC N0.5675 ο
[0009]优选的，所述厦门链霉菌经发酵培养可高产斑鸠霉素及其衍生物。
[0010]优选的，所述厦门链霉菌高产斑鸠霉素及其衍生物的培养基为每1000ml去离子水中加入酵母提取物4g，麦芽提取物10克制备而得；所述培养基的pH值为7.0?7.2。
[0011]优选的，所述厦门链霉菌经发酵培养后，采用乙酸乙酯萃取发酵液，甲醇溶解后析出沉淀，并用氯仿复溶的方法，可实现快速提取高纯度的斑鸠霉素及其衍生物。
[0012]本发明还涉及一种生产斑鸠霉素及其衍生物的方法，采用厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC N0.5675发酵培养获得斑鸠霉素及其衍生物。
[0013]优选的，所述发酵培养采用的培养基为每100ml去离子水中加入酵母提取物4g，麦芽提取物10克制备而得；所述培养基的pH值为7.0?7.2。
[0014]优选的，所述厦门链霉菌经发酵培养后，采用乙酸乙酯萃取发酵液，甲醇溶解后析出沉淀，并用氯仿复溶的方法，提取得到高纯度的斑鸠霉素及其衍生物。
[0015]本发明根据基因组探矿的方法，对红树林来源的链霉菌进行筛选，从中发现厦门链霉菌，具有斑鸠霉素生物合成相关的ikaA，ikaB, ikaC基因。对该链霉菌的发酵产物的UPLC-MS分析表明该菌株可产生斑鸠霉素，但产量相对较低，小于10mg/L，通过培养基的优化(优化培养基后产量在100mg/L)，以及提取方式的探索，从而获得了制备斑鸠霉素的新菌株以及快速制备斑鸠霉素的方法。
[0016]本发明具有以下有益的效果:通过基因组探矿的方法进行筛选，能够预测菌株产生次生代谢产物的种类，从而达到靶向分离的目的，减少了系统分离提取及鉴定化合物的重复工作；筛选得到抗肿瘤活性化合物斑鸠霉素的新产生菌，由于是新的菌株来源，因此在化合物种类上有可能出现新的变化，从而产生新的结构；进一步可以通过代谢工程改造，获得高产突变株可以用于大规模工业发酵，具有明显的工业应用价值。
【附图说明】
[0017]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0018]图1为厦门霉素中斑鸠霉素生物合成基因簇示意图；
[0019]图2为厦门霉素发酵产物的高效液相色谱分析图，其中a为紫外吸收在325nm的高效液相色谱，b为斑鸠霉素的特征吸收紫外图；
[0020]图3为厦门霉素发酵产物的UPLC-MS质谱图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]本发明涉及从红树林来源的链霉菌中筛选得到产生斑鸠霉素的菌株，即厦门链霉菌，该方法具体为:
[0023]步骤一，通过对厦门链霉菌的基因组草图序列的生物信息学分析，发现具有斑鸠霉素生物合成基因族，如图1所不，即ikaA, ikaB, ikaC基因；
[0024]步骤二，对菌株进行发酵、有机溶剂萃取、HPLC分析，UPLC-MS确证，确定菌株产斑鸠霉素的能力(见附图2);
[0025]步骤三，培养基优化发现采用YM培养基能够提高斑鸠霉素的产量；
[0026]步骤四，斑鸠霉素的快速提取方法，通过采用乙酸乙酯萃取发酵液，甲醇溶解后析出沉淀，并用氯仿复溶的方法，能够获得高纯度的斑鸠霉素；
[0027]本发明通过基因组探矿的方法，发现厦门链霉菌具有斑鸠霉素生物合成基因簇，并进行培养基优化和提取方法的优化，获得一株新的斑鸠霉素产生菌，确定为厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)。
[0028]实施例1、厦门链霉菌中斑鸠霉素基因簇的比较
[0029]通过对厦门链霉菌的基因组草图序列的生物信息学分析，发现具有斑鸠霉素生物合成基因簇，即ikaA，ikaB, ikaC基因，并且同源性高，可以判断厦门链霉菌具有产生斑鸠霉素的能力。
[0030]斑鸠霉素的生物合成基因簇广泛存在于细菌中，其中特别是有多种链霉菌也具有ikaA, ikaB, ikaC基因，如图1所示。但是斑鸠霉素的生物合成基因在多数情况下都是沉默的，如何激活沉默基因并高产目标化合物，一直是微生物学乃至现在合成生物学领域研究的重点。
[0031]在本发明中，采用了特定的培养基优化的方法，发现斑鸠霉素被激活并高产。通过UPLC-MS分析发现，产生的斑鸠霉素的衍生物有斑鸠霉素(ikarugamycin)，butremycin, ripromycin,以及可能是新结构的类似物。具体见以下实施例2。
[0032]实施例2、厦门链霉菌发酵产物中斑鸠霉素的分析及确证
[0033]步骤一、厦门链霉菌发酵产物的分析
[0034]取菌株Streptomyces xiamenensis CGMCC N0.5675 抱子悬液 50ul 接种 50ml TSB培养基，28 0C，200rpm振荡培养48h后以1:20体积比例接种YM发酵培养基，30 °C，200 rpm发酵。第八天取发酵液，以乙酸乙酯萃取3次，取有机层真空旋蒸至膏状，用4ml分析级甲醇溶解，0.22mm纤维素膜过滤后进行高效液相色谱分析。YM发酵培养基配方:酵母提取物4g，麦芽提取物10g，去离子水1000ml，pH7.0-7.2。
[0035]步骤二，利用高效液相色谱对厦门链霉菌中的斑鸠霉素进行分析
[0036]色谱分析工作条件为:色谱柱:Aglilent ZORBAXExtend-C18 (5 μ m, 4.6 X 150mm)，流速1.0ml/min ;流动相为加0.5%。三氟乙酸的甲醇和加0.5%。三氟乙酸的水，20% -100%甲醇比例进行梯度洗脱；检测波长:采用斑鸠霉素的特征吸收峰254nm和324nm ;柱温40 °C。
[0037]步骤三，利用UPLC-MS对厦门链霉菌中的斑鸠霉素进行确证
[0038]色谱柱:ACQUITYBEH C18，2.1 X 100mm, 1.7 μ m ;流动相 A:0.1 % 甲酸水溶液；流动相B:0.1 %甲酸乙腈；流速0.4mL/min ;进样量:5 μ L ;柱温:45°C，梯度洗脱条件:梯度洗脱条件:0min、5%B，2min、30%B，4.5min、60% B，12min、100% B。质谱条件:采用电喷雾离子化源，正离子模式离子全扫瞄范围:100?lOOOamu，扫描速度0.25s。离子源参数:雾化气温度350°C ;雾化气流量600h/L ;毛细管电压(即质谱喷雾电压)3000V ;锥孔电压35V。图3为厦门霉素发酵产物的UPLC-MS质谱图，可见能够检测到斑鸠霉素特征质谱峰。
[0039]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【主权项】
1.一种厦门链霉菌在用作斑鸠霉素新产生菌中的用途，其特征在于，所述厦门链霉菌为厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC N0.5675。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述厦门链霉菌经发酵培养可高产斑鸠霉素及其衍生物。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述厦门链霉菌高产斑鸠霉素及其衍生物的培养基为每100ml去离子水中加入酵母提取物4g，麦芽提取物10克制备而得；所述培养基的pH值为7.0?7.2。4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述厦门链霉菌经发酵培养后，采用乙酸乙酯萃取发酵液，甲醇溶解后析出沉淀，并用氯仿复溶的方法，实现快速提取得到高纯度的斑鸠霉素及其衍生物。5.—种生产斑鸠霉素及其衍生物的方法，其特征在于，采用厦门链霉菌(Streptomycesxiamenensis) CGMCC N0.5675发酵培养获得斑鸠霉素及其衍生物。6.根据权利要求5所述的生产斑鸠霉素及其衍生物的方法，其特征在于，所述发酵培养采用的培养基为每100ml去离子水中加入酵母提取物4g，麦芽提取物10克制备而得；所述培养基的PH值为7.0?7.2。7.根据权利要求5所述的生产斑鸠霉素及其衍生物的方法，其特征在于，所述厦门链霉菌经发酵培养后，采用乙酸乙酯萃取发酵液，甲醇溶解后析出沉淀，并用氯仿复溶的方法，提取得到高纯度的斑鸠霉素及其衍生物。
【专利摘要】本发明涉及一种厦门链霉菌在作为斑鸠霉素新产生菌中的用途。本发明利用红树林土壤来源的厦门链霉菌(Streptomyces？xiamenensis)CGMCC？No.5675，进行基因组探矿分析和化合物靶向分离，获得多环稠合的大环内酰胺类抗肿瘤活性化合物斑鸠霉素的新产生菌。本发明为发酵生产斑鸠霉素提供了新的菌种来源和制备方法。CGMCC NO.567520111229
【IPC分类】C12P17/18, C12R1/465
【公开号】CN105112472
【申请号】CN201510542281
【发明人】徐岷涓, 徐俊, 余河霖, 王佳华
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月28日