专利名称：泰乐菌素残留快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测兽药的器具，特别是涉及一种泰乐菌素(Tylosin，本文简称TL)残留快速检测试纸条。
二、技术背景泰乐菌素是抗生素类药，用于革兰氏阴性细菌及支原体感染。从弗氏链霉菌的一类似菌株培养液中取得，为白色结晶，微溶于水，具弱碱性，一般成盐后易溶于水，泰乐菌素对革兰氏阳性菌和一些阴性菌有抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、化脓棒状杆菌均敏感。在蜂养殖、畜禽饲养过程中，兽药泰乐菌素不仅用于预防和控制畜禽、蜜蜂的疾病，并且具有促生长作用，是目前广泛添加于饲料中的药物，其耐药性问题日益突出，这是蜜蜂、奶牛、生猪、禽肉等产品变为非安全的食品的重要因素之一。欧盟早在1999年已经禁用泰乐菌素作为饲料添加剂使用，香港规定了畜禽肉品及牛奶、蜂蜜等产品中最高残留限量。我国禁用复方泰乐菌素，同时在中华人民共和国农业部公告(第278号)中严格规定了泰乐菌素在猪牛养殖中的停药期，我国首批绿色畜产品认证准则中《饲料和饲料添加剂准则》明确规定禁止使用泰乐菌素作为药物性饲料添加剂，无公害蜂产品规定了泰乐菌素残留检测的检测标准和方法，泰乐菌素现有的检测方法主要有高压液相色谱法、气相色谱法、气质连用法以及ELISA等。色谱技术是非常有效、准确、敏感的方法，但是待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时，从样品预处理到得出检验结果至少需2～3天时间，检测费用很高。另一方面这种检测方法还必须有昂贵的仪器设备。只有特定的专业人员才能应用，而且每次检测的样品有限，不适应大批样品的筛查，严重阻碍了该检测方法的推广应用，更不适应于现场检验。ELISA也是一种常用的检测技术，它是以竞争性酶联反应为检测原理，检测全过程约需2-4小时。由于ELISA是一种敏感性很强的检测方法，不同的操作者往往会出现不同的结果，所以该方法常常造成人为的误检和漏检。因此在实际生产中急需一种快速检测泰乐菌素的检测方法。目前各级食品检验部门，尤其是外贸出口单位，加强了泰乐菌素的检测力度，以确保人民群众的动物性食品安全。因此研制灵敏、快速，准确的泰乐菌素检测方法，检测蜂蜜、牛奶及家畜家禽等产品和组织饲料中是否含泰乐菌素有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的研制出特异、敏感、快速、简便的泰乐菌素残留快速检测试纸条。
本发明的技术方案一种泰乐菌素残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联泰乐菌素的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“||”。
支撑层是用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成。
测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酯膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。
纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或羧化纤维素膜制成。
金标抗体纤维层用吸附泰乐菌素的金标抗体玻璃棉，泰乐菌素金标抗体为胶体金标记泰乐菌素的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联泰乐菌素的载体蛋白溶液为泰乐菌素与载体蛋白偶联的复合溶液。
在测试端吸跗纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。
偶联泰乐菌素的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或为鸡卵清白蛋白(OVA)，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。
本发明的泰乐菌素残留快速检测试纸条具有以下优点(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体(W1)为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体(W1)特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到0.1纳克的微量TL残留。
(2)操作简便、快速。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品10秒左右，在2分钟内即可判定检测结果。
(3)结果显示形象、直观、准确。本测试纸条以显示红棕色“|”及“‖”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“|”印迹表示在被检测样品液中含有TL，两条棕红色“‖”印迹表示在被检样品中不含TL，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。
(5)应用范围广，便于推广应用。本发明快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
四
图1为泰乐菌素残留快速检测试纸条结构示意图。
图2为泰乐菌素残留快速检测试纸条俯视结构示意图。
图中，1支撑层，2测试端纤维层，3金标抗体纤维层，4纤维素膜层，5吸水材料层，6隐形检测印迹带，7隐形对照印迹带，8-1测试端保护膜，8-2手柄端保护膜，9标记线。
五具体实施例方式制备泰乐菌素残留快速检测试纸条，首先需制备偶联TL的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维；其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。
1.泰乐菌素TL与载体蛋白Xi的偶联采用羧甲基羟胺法或碳化二亚胺(EDC)法碳化二亚胺(EDC)法将TL与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原。将5mg泰乐菌素溶解于磷酸盐缓冲液中(pH7.0)中，加入10mgEDC，室温避光搅拌6小时。将载体牛血清白蛋白(或鸡卵清白蛋白或铁蛋白，或血蓝蛋白)溶于PBS缓冲液中，按摩尔比25∶1加入上反应中，温室搅拌过夜。将反应液用PBS(磷酸缓冲液)透析即可。
2.抗泰乐菌素单克隆抗体(W1)的制备以50～100μg/只的偶联TL的载体蛋白免疫BALB/c系小鼠三次，每次间隔15～30天；第三次加强免疫后3～4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，用75％酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与2～5×107的NS0骨髓瘤细胞，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃的水溶中缓缓加入0.7～1ml的40～50％PEG4000(pH 8.5～9.0)作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100～200μl/孔)，置于37℃5％CO2培养箱中培养。培养7～10天后，以5～1Q μg/ml的偶联TL的载体蛋白包被酶标板(96孔/块)，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强性细胞克隆(OD450＝0.5以上)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92～98，其分泌的单克隆抗体(W1)特异地与TL反应，而不与其它蛋白发生交叉反应，亲和力常数达109～10，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，针对TL特异抗原决定簇的单克隆抗体(W1)，用于制备金标抗体。
3.泰乐菌素金标抗体(W1)和金标抗体玻璃棉的制备以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50～100ml沸腾的0.01～0.05％氯金酸水溶液中加入2～4ml的0.5～2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K2CO3调胶体金pH至8.5～9.5，置于以1∶1000～1300的标记比将待标记的TL单克隆抗体(M1)加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得TL胶体金标记抗体。将1∶(100～500)稀释的胶金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备TL金标抗体玻璃棉。
4.羊抗或兔抗小鼠IgG的制备以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS(pH 7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min离心15min，弃上清；以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min离心15min，弃上清，以少量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(pH7.2)过夜透析，换液2～3次，4℃、12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50～100μg/kg体重(小鼠血清IgG)经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3～4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于TL快速检测试纸条对照显示印迹的制备。
5.泰乐菌素TL快速检测试纸条实施检测反应原理当泰乐菌素TL快速检测试纸条样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检TL及金标抗体棉中的金标抗体(W1)一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗入手柄端滤纸中，扩散过程中待检TL可与金标抗体(W1)相结合，进而封闭金标抗体(W1)上TL的抗原结合点，阻止金标抗体(W1)与纤维素膜上偶联TL的载体蛋白(Xi)的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊抗或兔抗小鼠IgG(Y)则可与金标抗体(W1)结合，形成红棕色对照印迹“|”，即一条红棕色“|”印迹为阳性标记，反之样品溶液中无TL则不能阻止金标抗体(W1)与纤维素膜上偶联TL的载体蛋白(Xi)检测印迹结合，显示红棕色检测印迹“|”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG(Y)也与金标抗体(W1)结合，显示红棕色对照印迹“|”，形成两条红棕色“‖”为阴性标记，如果纤维素膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。
实施例一泰乐菌素残留快速检测试纸条的结构，参见图1、图2。图中1为支撑层，用塑胶条制成，2为测试样品端的纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附有泰乐菌素TL的金标抗体(W1)纤维层，根据上述具体实施方式
3中所述的制备方法，制备吸附有泰乐菌素单克隆抗体的金标抗体(W1)玻璃棉，4为纤维素膜层，采用硝酸纤维素膜，5为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从左至右依次粘贴固定在塑胶条1上，各层交界处纤维互相交叉渗透。在硝酸纤维素膜层4上，6为用偶联泰乐菌素的牛血清白蛋白(BSA)溶液印上检测印迹“|”，7为用羊抗小鼠IgG(Y)溶液印上对照印迹“|”，两印迹平行排列形成组合印迹带“‖”。8-1为覆盖在纤维层2和金标抗体纤维层3上面的测试样品端白色保护膜，在2和3交界处对应保护膜8-1位置上偏向于纤维层2一侧0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，手柄端吸水层5上覆盖有其它颜色(如黄色)保护膜8-2。
检测样品液的制备若检测动物的尿液样品，可直接取动物的尿液作为检测样品；若检测肉、肉制品或其它组织样品，可将组织样品剪碎、研磨，将肉样和生理盐水以1∶1～100的比例制成样品悬液；若检测对象是蛋、奶或蜂蜜，可直接将蛋、奶或蜂蜜用生理盐水制成1∶1～100待检测样品悬液；若检测的对象是动物的血液，则提取血清，用生理盐水将血清制成1∶1～100作为待测样品。
检测操作方法将TL快速检测试纸条样品端插入待检测样品液中，插入深度不超过标记线，约10秒后取出检测试纸条，水平放置约2分钟，观察结果。
检测结果判断如果在纤维素膜上有一条红棕色标记“|”显示，检测结果呈阳性，表示在被检测样品液中含TL，含量超过国家残留标准的产品不能在市场上流通；如果TL快速检测试纸条上的纤维素膜上出现两条红棕色标记“‖”，检测结果呈阴性，表示待检样品中不含泰乐菌素成份。
实施例二泰乐菌素残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于支撑层1用不吸水的硬纸条制成，测试端纤维层2用尼龙膜，金标抗体纤维层3吸附有胶金标记的泰乐菌素TL多克隆抗体，纤维素膜层4采用纯纤维素膜，隐形检测印迹带6中偶联TL载体蛋白溶液为铁蛋白，隐形对照印迹带7用兔抗小鼠IgG溶液在纤维素膜上制备而成。
检测样品制备检测肉样，将样品切碎、研磨，将肉样和生理盐水以1∶30的比例制成待检测样品悬液。
其它操作方法和结果判定均同实施例一，不重述。
实施例三泰乐菌素残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于测试端吸附纤维层2用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，隐形检测印迹带6中偶联TL载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白(OVA)，隐形对照印迹带7用羊抗小鼠IgG溶液在纤维素膜上制备而成。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例一，不重述。
实施例四泰乐菌素残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于测试端吸附纤维层2用聚酯膜，金标抗体纤维层3吸附有胶金标记的TL多克隆抗体，隐形检测印迹带6中偶联TL载体蛋白溶液为血蓝蛋白。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定均同实施例一，不重述。
权利要求
1.一种泰乐菌素残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，其特征是吸附层从测试端依次为纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联泰乐菌素的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“‖”。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是吸水材料层用吸水纸制成。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜制成。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是金标抗体纤维层用吸附泰乐菌素的金标抗体玻璃棉，泰乐菌素金标抗体为胶体金标记的泰乐菌素单克隆抗体或多克隆抗体，偶联泰乐菌素的载体蛋白溶液为泰乐菌素与载体蛋白偶联的复合溶液。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。
8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是偶联泰乐菌素的载体蛋白为牛血清白蛋白，或为鸡卵清白蛋白，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种泰乐菌素残留快速检测试纸条。试纸条底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联泰乐菌素的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“‖”。试纸条具有以下优点特异性强，敏感性高，可检测到0.1纳克的微量TL残留，操作简便、快速，在2分钟内即可判定检测结果；结果显示形象、直观、准确，不易出现假阴性和假阳性误判；并且成本低，应用范围广，便于推广应用。
文档编号G01N33/577GK101029893SQ20061012842
公开日2007年9月5日 申请日期2006年12月19日 优先权日2006年12月19日
发明者张改平, 赵东, 邓瑞广, 李学伍, 杨艳艳, 肖治军, 王选年, 王自良, 邢广旭, 杨继飞, 柴书军, 刘庆堂, 罗俊, 郝桂芳, 王丽, 藤蔓 申请人:河南省农业科学院生物技术研究所