一种碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于检测材料领域，特别涉及一种碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条。
【背景技术】
[0002]碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,简称ALP),是一种广泛存在于生物体内的膜结合蛋白，它直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程。碱性磷酸酶存在于人体几乎所有的组织中，主要用于肝胆疾病和骨骼疾病的诊断，尤其对于骨骼疾病具有重要的意义。从食品安全角度考量，碱性磷酸酶是乳牛细胞中的代谢产物，也是乳中天然存在的一种酶，它对温度的稳定性比乳中存在的病原菌略高，巴氏灭菌后通过对ALP酶的灭活可以确保绝大部分的病原微生物都被杀死。如果巴氏灭菌后ALP显阳性说明巴氏杀菌不彻底或者经巴氏灭菌后的生鲜乳被二次污染，所以ALP活性测定是一种重要的卫生安全指标。因此欧盟和美国相继用ALP活性作为一种重要的卫生安全指标评价生鲜牛乳巴氏杀菌水平。
[0003]现阶段ALP活性检测需要由专业人员利用大型仪器进行检测，这就局限了便携式、快速对样品中的碱性磷酸酶进行检测，尤其是在牛奶及奶制品的食物安全方面的应用。免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，来提供对生物样品的定量检测数据，从而实现特异性的免疫诊断。与常规诊断方法相比，该技术分析速度快，全部检测过程仅需5-30分钟。操作简便，不需要其它任何仪器，无需专业人员，为实时实地检测提供了条件。在免疫层析试纸条中，通常采用抗体-抗原-抗体形成三明治夹心或者形成竞争结合实现对样品的检测。因此只能对待检物的浓度进行检测，而不能提供活性分析，因此在酶类物质的检测上面有一定缺陷。因此，急需一种能够检测碱性磷酸酶的检测试纸，不需要大型仪器，操作简单，能够用于即时检测。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本实用新型的目的在于提供一种碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，该试纸条能够即时对碱性磷酸酶活性进行定量检测，不需要大型仪器，操作简单。
[0005]为实现上述目的，本实用新型提供如下技术方案:
[0006]碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，包括底板和上层透明密封膜，所述底板和上层透明密封膜之间依次相互交错设置有样品垫、磷酸化反应垫、抗体包被膜和吸水垫，所述磷酸化反应垫固定有结合了磷酸化生物分子的显色物质、所述抗体包被膜包被有抗所述磷酸化生物分子的抗体、与磷酸化生物分子异性结合的核酸适配体或抗所述磷酸化生物分子去磷酸化后产物的抗体。
[0007]优选的，所述样品垫、磷酸化反应垫、抗体包被膜和吸水垫之间相互交错2mm。
[0008]优选的，所述磷酸化生物分子为磷酸化氨基酸、磷酸化蛋白、磷酸化肽或磷酸化核酸。
[0009]更优选的，所述磷酸化氨基酸为磷酸化酪氨酸。
[0010]优选的，所述显色物质为金纳米颗粒，银纳米颗粒或量子点。
[0011]优选的，抗所述磷酸化生物分子的抗体为抗磷酸化酪氨酸的抗体；所述与磷酸化生物分子异性结合的核酸适配体为与磷酸化酪氨酸特异性结合的核酸适配体。
[0012]优选的，所述上层透明密封膜为透明塑料膜。
[0013]本实用新型的有益效果在于:本实用新型公开的碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，具有简便快速，检测周期短，单人份操作的优点，利用碱性磷酸酶和磷酸化生物分子的相互作用，同时利用抗磷酸化生物分子抗体对磷酸化分子进行特异性识别，对酶作用于底物后生成的产物进行检测，从而实现定量检测的同时对酶功能活性进行检测，弥补了传统免疫层析技术单纯对浓度进行考察的缺陷，代表了当今即时检验技术发展的方向和潮流。
【附图说明】
[0014]为了使本实用新型的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0015]图1为碱性磷酸酶活性免疫层析试纸条的结构示意图(1.样品滴加部位；2.磷酸化酪氨酸修饰的纳米金颗粒固定垫；3.抗磷酸化酪氨酸抗体固定部位(检测区)；4.吸水纸)。
[0016]图2为制备磷酸化酪氨酸标记纳米金颗粒的原理图；(I)半胱氨酸通过其巯基与纳米金结合得到半胱氨酸修饰的纳米金颗粒；(2)利用戊二醛将磷酸化酪氨酸与纳米金颗粒表面的半胱氨酸交联，得到磷酸化酪氨酸修饰的纳米金颗粒；AuNPs为金纳米颗粒；AuNPsiCys-Try-p为磷酸化酪氨酸修饰的纳米金颗粒。
[0017]图3为磷酸化酪氨酸修饰的纳米金颗粒的表征结果(A:扫描电镜图:紫外-可见吸收谱；C:Zeta电位；D.粒径大小分布；B?D中a表示未修饰的纳米金颗粒；b表示半胱氨酸修饰的纳米金颗粒；c表示磷酸化酪氨酸修饰的纳米金颗粒)。
[0018]图4为磷酸化酪氨酸标记纳米金为显色示踪的碱性磷酸酶活性免疫层析试纸条的检测原理图。
[0019]图5为制备试纸条的条件优化(A为制备试纸条的条件优化结果，B为制备试纸条的条件优化结果的柱状图)。
[0020]图6为碱性磷酸酶活性免疫层析试纸条检测牛奶中碱性磷酸酶含量的实验结果(A为碱性磷酸酶活性免疫层析试纸条检测牛奶中碱性磷酸酶含量的实验结果，B为碱性磷酸酶活性免疫层析试纸条检测牛奶中碱性磷酸酶含量的实验结果的标准曲线)。
【具体实施方式】
[0021]下面将结合附图，对本实用新型的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，其结构如图1所示，包括底板和上层透明密封膜，所述底板和上层透明密封膜之间依次相互交错设置有样品垫、磷酸化反应垫、抗体包被膜和吸水垫。优选的，样品垫、磷酸化反应垫、抗体包被膜和吸水垫之间相互交错2mm，其中磷酸化反应垫结合有金纳米颗粒，金纳米颗粒上结合有磷酸化酪氨酸，抗体包被膜包被有抗磷酸化酪氨酸的抗体或抗去磷酸化酪氨酸抗体。本发明中磷酸化酪氨酸可以用其他磷酸化生物分子替换，如磷酸化蛋白、磷酸化肽或磷酸化核酸等，同时将抗体包被膜上的抗体替换为识别相应磷酸化生物分子的抗体或生物分子去磷酸化产物的抗体，金纳米颗粒也可以替换为银纳米颗粒或量子点；上层透明密封膜优选为透明塑料膜。
[0023]碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条的制备方法如下(图2):磷酸化酪氨酸修饰的金纳米颗粒制备方法:首先，2毫升1% (m/V) HAuCl4 (双蒸水稀释)加入19