8毫升双蒸水中混合均匀，混合后的HAuCl4S液通过油浴加热煮沸，然后加入4毫升I % (m/V)柠檬酸三钠水溶液，反应约30分钟，HAuCl4溶液变成红色，得到金纳米颗粒(AuNPs);取10毫升金纳米颗粒溶液并加入10毫升(I毫克/毫升_)L-半胱氨酸，在室温(25°C )条件下搅拌反应2小时；收集混合液于透析袋中，4°C水溶液中透析10小时，每2小时更换I次双蒸水，获得半胱氨酸修饰的金纳米颗粒；随后取5毫升磷酸化酪氨酸(500 μ M)与5mL半胱氨酸修饰的金纳米颗粒溶液混合，然后取50微升戊二醛水溶液(50%水溶液，v/v)缓慢滴加入磷酸化酪氨酸和半胱氨酸修饰的金纳米颗粒溶液的混合物，(25°C)条件下搅拌反应2小时；然后，在冰浴条件下滴加50微升0.1% (WZV)NaBH4水溶液进入混合物。最后，通过透析去除游磷酸化酪氨酸和戊二醛，并通过聚乙二醇(WM 20000)将混合物浓缩到5毫升，获得磷酸化酪氨酸修饰的金纳米颗粒。磷酸化酪氨酸修饰的金纳米颗粒的表征结果如图3所示。结果显示，获得的磷酸化酪氨酸修饰的金纳米颗粒的粒径大约为21.7nm，并且金纳米颗粒表面经修饰后紫外可见吸收光谱红移约10nm，表明在修饰过程中金纳米颗粒逐渐被氨基酸包裹；另外Zeta电位绝对值变大，表明经修饰后金纳米颗粒的稳定性更好；另外对粒径分析也可以看出，修饰后粒径更加均匀，为制备检测免疫试纸条的理想材料。
[0024]磷酸化酪氨酸修饰的金纳米颗粒包被垫的准备:分别用10yL、20yL、30yL和40 μ L磷酸化酪氨酸修饰的金纳米颗粒滴加到玻璃纤维膜上，25°C干燥备用；抗磷酸化酪氨酸抗体包被区制备:1.5 μ L(浓度分别为0.5mg/mL、l.0mg/mL和2mg/mL)抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体喷点到硝酸纤维素膜，25°C放置I小时后，用质量分数为2%的BSA封闭硝酸纤维素膜30分钟，再在室温(25°C)干燥，最后将样品结合垫、磷酸化反应垫、抗体包被膜和吸水垫相互交错2mm固定于PVC底板上，表面用透明塑料密封膜即组装成碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条。
[0025]制得的碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条利用金纳米颗粒结合的磷酸化酪氨酸与碱性磷酸酶(ALP)发生反应，然后利用抗磷酸化酪氨酸抗体(与磷酸化生物分子异性结合的核酸适配体或抗所述磷酸化生物分子去磷酸化后产物的抗体)与磷酸化酪氨酸结合来检测活性碱性磷酸酶的浓度及含量，其检测原理如图4所示。图4中使用AuNPs@Cys-Tyr-p的碱性磷酸酶活性的检测基于横向流地带。(A)用含有碱性磷酸酶的样品溶液加入样品结合垫，然后样品中的碱性磷酸酶去除修饰于纳米金颗粒上的磷酸化酪氨酸上的磷酸基团
(I);接着去磷酸化的纳米金颗粒向前迀移至抗磷酸化酪氨酸抗体固定区(2);最后去磷酸化的纳米金颗粒无法被抗磷酸化酪氨酸抗体捕获，继续向前迀移至吸水垫，因此在抗体固定区无可视条带生成(3);但如果样品溶液中无碱性磷酸酶或含变性碱性磷酸酶，磷酸化酪氨酸标记纳米金颗粒迀移至固定了抗磷酸化酪氨酸抗体区域，并被特异性抗体捕获，在该区域形成可视条带(B)。所以该方法可以通过肉眼观察，拍照后用图像软件分析光密度，以实现定量分析。
[0026]然后利用制得的碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条检测:将35 μ L检测样品滴加到样品垫上，液体沿着试纸条向吸水垫方向迀移，用热变性的碱性磷酸酶作为检测的阴性对照物；约10分钟后，利用智能手机上的相机对试纸条进行拍照，所有的实验都独立地重复至少三次，然后根据显色结果绘制柱状图，结果如图5所示。结果显示，40微升磷酸化酪氨酸修饰的纳米金颗粒用量及1.5微升2mg/ml抗磷酸化酪氨酸抗体检测效果最佳。
[0027]利用制得最佳条件制得的碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条检测牛奶中碱性磷酸酶含量:分别利用含不同浓度碱性磷酸酶的牛奶滴加到样品垫上，液体沿着试纸条向吸水垫方向迀移，用热变性的碱性磷酸酶作为检测的阴性对照物；约10分钟后，利用智能手机上的相机对试纸条进行拍照，所有的实验都独立地重复至少三次，然后根据显色结果绘制标准曲线(图6)。结果显示，在碱性磷酸酶浓度为I?100U/L范围内呈线性相关。
[0028]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，其特征在于:包括底板和上层透明密封膜，所述底板和上层透明密封膜之间依次相互交错设置有样品垫、磷酸化反应垫、抗体包被膜和吸水垫，所述磷酸化反应垫固定有结合了磷酸化生物分子的显色物质、所述抗体包被膜包被有抗所述磷酸化生物分子的抗体、与磷酸化生物分子异性结合的核酸适配体或抗所述磷酸化生物分子去磷酸化后产物的抗体。
2.根据权利要求1所述碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，其特征在于:所述样品垫、磷酸化反应垫、抗体包被膜和吸水垫依次交错2mm。
3.根据权利要求1或2所述碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，其特征在于:所述磷酸化生物分子为磷酸化氨基酸、磷酸化蛋白、磷酸化肽或磷酸化核酸。
4.根据权利要求3所述碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，其特征在于:所述磷酸化氨基酸为磷酸化酪氨酸。
5.根据权利要求1或2所述碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，其特征在于:所述显色物质为金纳米颗粒，银纳米颗粒或量子点。
6.根据权利要求1或2所述碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，其特征在于:抗所述磷酸化生物分子的抗体为抗磷酸化酪氨酸的抗体，所述与磷酸化生物分子异性结合的核酸适配体为与磷酸化酪氨酸特异性结合的核酸适配体。
7.根据权利要求1或2所述碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，其特征在于:所述上层透明密封膜为透明塑料膜。
【专利摘要】本实用新型涉及碱性磷酸酶快速检测免疫试纸条，包括底板和上层透明密封膜，所述底板和上层透明密封膜之间依次相互交错设置有样品垫、磷酸化反应垫、抗体包被膜和吸水垫，所述磷酸化反应垫固定有结合了磷酸化生物分子的显色物质、所述抗体包被膜包被有抗所述磷酸化生物分子的抗体或抗所述磷酸化生物分子去磷酸化后产物的抗体，该试纸条能够快速检测碱性磷酸酶的活性，不需要大型仪器，检测成本低，市场前景好。
【IPC分类】G01N33-544, G01N33-577
【公开号】CN204330778
【申请号】CN201420545290
【发明人】余玲, 史转转, 李长明
【申请人】西南大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年9月22日