一种便携家庭式梅毒快速检测试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检测领域，尤其涉及一种便携家庭式梅毒快速检测试纸条。
【背景技术】
[0002] 目前，体外培养梅毒病原体仍然没有实现。因此，临床上和实验室对于梅毒的诊断 主要集中在血清学特征的检测。虽然也可以通过直接确定病原体进行诊断，但是现有的技 术主要是利用暗视野显微镜对样品直接观察，这样的操作具有较强的主观性，即使非常有 经验的检测者，也可能会出现假阴性结果；PCR方法也可直接测定病原体的存在，但是该方 法的费用昂贵，不易作为血站和医院的常规检测。由此可见，梅毒患者血清学检测在梅毒诊 断方面至关重要。血清学诊断包括特异和非特异两种方法，二者之间存在区别。非特异性 梅毒诊断方法主要有VDRL、USR、RPR和TRUST等试验，它们具有相同的抗原成分，即一种由 美国Pangborn等发现的性病研究实验室抗原（VDRL)，从牛心肌中提取的心拟脂，适量加入 胆固醇及卵磷脂以提高敏感性，通常称这种抗原为心拟脂抗原，可有效诊断神经梅毒。但 该类方法的特异性受生物学假阳性反应和某些生理性反应的影响，即该方法的灵敏度依赖 于病程所处阶段。因此，非特异性梅毒诊断方法只能有限用于常规筛查。特异性梅毒抗体 检测方法有 FTA-ABS 法（Fluorescent Treponemal Antibody Absorption，梅毒焚光抗体 吸附法）、TPHA 法（Treponema Pallidum Hemagglutination Assay)、TPPA 法（Treponema Pallidum Particle Agglutination Assay),、Captia·? Syphilis G/Syphilis M法等。特 异性方法常用于非特异性方法阳性样本的确认，TPHA/TPPA法也常用于初筛结果的确证。特 异性抗梅毒抗体与疾病的进程没有相关性，即使经过治疗也能终身携带。在特异性梅毒抗 体检测方法中，FTA-ABS具有高敏感性，尤其针对早期梅毒，但在HIV感染、自身免疫疾病和 怀孕的时候会发生一定比例的假阳性结果（0.35%)。FTA-ABS法对各阶段的梅毒都敏感， 但评价具有主观性，有时较困难且复杂，不适合用于初步筛查，仅适用于确证。其他几种特 异性梅毒抗体检测方法也具有同样的问题，由于传统的梅毒诊断方法比较繁琐，耗时较长， 不易推广。
[0003] 申请号为02137626. 3的专利公开了一种用于诊断梅毒螺旋体感染的梅毒螺旋体 抗体酶标诊断试剂。它包括用合成肽抗原或基因工程表达的抗原：P15、P17、P47抗原0. 1~ 10μg/ml包被在酶标板上、酶标二抗（IgG、IgM):含1 : 20~1 : 100K酶标二抗稀释溶液 和显色剂组合及增溶剂，所述的显色剂组合中的显色剂是TMB丙磺酸钠。显色剂组合可包 括TMB丙磺酸钠与过氧化氢异丙苯或其衍生物的组合或TMB丙磺酸钠与羟基脲的组合。这 种梅毒螺旋体抗体酶标诊断试剂，在应用合成肽抗原、基因工程表达的抗原基础上，使用了 一种水溶性极好、性能稳定的TMB盐类，配合适量的增溶剂、稳定剂，使梅毒螺旋体抗体酶 标诊断试剂获得了更好的稳定性能。其高特异性、高灵敏度、操作简便、试剂稳定，使得梅毒 检测能自动化、血源批量筛选、规范化管理得到了保证。
[0004] 上述方法的缺点是主要以酶联免疫反应为主要原理对样品进行检测，需要酶标 仪，孵育温箱等大型仪器，不适合家庭使用。且操作复杂，耗时较长，不利于快速的初筛检 测。
[0005] 申请号为201010215044. 8的专利公开了一种基于流式微球载体技术的梅毒螺旋 体（TP)抗体检验试剂盒及其制备和检测方法，属于免疫分析医学诊断技术领域。具体包括 用TP重组抗原包被高聚分子微球，用牛血清白蛋白封闭空白结合点，制成特异性TP探针一 高聚分子微球；与待测标本共培养捕获TP抗体，洗涤离心除去未结合的TP抗体，再加入荧 光标记的抗人IgG或IgM抗体；使用流式细胞仪检测微球的荧光强度，对受测抗体进行定性 或定量分析。本方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点，并可对标本进行微量、多价 分析。
[0006] 上述方法的缺点是需要使用流式细胞仪这种昂贵大型仪器，该仪器在血站和基层 医院的配置较少，且该仪器的保养维护成本较高，不适用推广，且无法进行家庭使用和检 测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种便携家庭式梅毒快速检测试纸条，旨在解决传统的梅 毒诊断方法比较繁琐，耗时较长，费用高，不易推广的问题。
[0008] 本发明是这样实现的，一种便携家庭式梅毒快速检测试纸条包括样本垫、结合垫、 硝酸纤维素膜和吸附垫，梅毒抗原作为捕获抗原被固定到硝酸纤维素膜上，胶体金标记试 剂吸附在结合垫上。
[0009] 进一步，以梅毒抗原TP17和TP47构建大肠杆菌表达载体，梅毒抗原的表达、纯化 和鉴定方法为：
[0010] 利用大肠杆菌密码子的偏嗜性人工设计并合成基因，合成的基因两端含有BamH I 和Not I位点，表达载体为pETDuet-1，该表达载体含有T7启动子，在IPTG的诱导下，外源 基因在T7RNA聚合酶的作用下转录表达；
[0011] 所述表达载体的c端含有His *Tag序列，表达的外援蛋白用金属螯合亲和层析法 纯化，在设计目的基因时，插入12KD大小的分子伴侣肽链，将表达的外援蛋白分泌到细胞 周质中；
[0012] 将合成的外源基因通过酶切链接插入到载体pETDuet-Ι中，转化大肠杆菌BL21 中，通过IPTG诱导表达，抗原以可溶性形式表达于细菌周质中，收集细菌，超声破碎，上清 通过金属螯合和分子筛层析，纯化的蛋白通过SDS-PAGE、Western-blot鉴定。
[0013] 进一步，所述便携家庭式梅毒快速检测试纸条的制备方法包括：
[0014] 步骤一、TP目的基因的设计和克隆；
[0015] 通过美国国立生物技术信息中心网站，查找梅毒螺旋体TP-17和TP-47的全基因 组序列；
[0016] 合成目的基因开放阅读框内的cDNA序列，并将合成好的序列克隆入pMDIS-T Simple载体，在进行序列合成时，分别在目的序列的5'端和3'端插入BamH I和Not I的 酶切位点，并利用这两种限制性内切酶将目的基因从PMD18-T Simple载体上剪切下来，进 行琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收电泳条带；
[0017] 将回收的目的条带通过去磷酸化酶处理后，与经同样限制性内切酶及去磷酸化酶 处理的pETDuet-Ι载体在T4连接酶存在的条件下，16°C连接过夜；将连接好的载体电转到 大肠杆菌DH10B菌种的感受态细胞中，涂布于含有50 μ g/ml氨苄抗生素的LB固体培养板 中，37°C培养过夜；第二天挑取单克隆接种到含有50 μ g/ml氨苄抗生素的5ml LB液体培养 基中，37°C，250rpm，震荡培养过夜；第三天利用小抽质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，进 行BamH I和Not I双酶切并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；将具有目的条带的阳性质粒电转 到大肠杆菌BL21菌种的感受态细胞中，重复以上操作，涂板，挑克隆进行液体培养后，通过 Bam HI和Not I双酶切及琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，将含有目的条带的质粒或菌液进行测 序；
[0018] 步骤^、目的蛋白的表达和纯化；
[0019] 将含有正确目的基因TP17和TP47序列的质粒的菌液分别接种至50ml含有 50 μ g/ml氨苄抗生素的LB液体培养基中，于250rpm，37 °C培养过夜；随后将两瓶50ml过夜 培养的菌液接种到1L含有50 μ g/ml氨苄抗生素的LB液体培养基中，37°C，250rpm震荡培 养；
[0020] 当菌液的A_0D值为0. 2~0. 4时，将培养箱温度调至22°C，依然250rpm震荡培 养2. 5~3h ;当菌液的A6QQ0D值为0. 9~1. 0时，加入IPTG诱导剂至终浓度为lmmol/L，将 培养箱温度调至18°C，250rpm震荡培养过夜；
[0021] 第二天收集菌液，4000g，离心20min，收集菌体沉淀，称重，记录菌体重量；
[0022] 然后按照lg菌体重量加入5ml浓度为0. 1M的磷酸盐缓冲液重悬细菌；
[0023] 将重悬后的菌液放在冰上，进行超声破碎，超声处理10s，暂停20s，作用lOmin后， 于12000g，离心25min，收集上清；将收集到的上清继续于12000g，离心25min，再收集上清； 再次重复上述操作，然后将收集到的上清通过0. 45 μ m的滤膜，用BCA试剂盒检测溶液中的 蛋白浓度，记录结果；
[0024] 选用GE公司的Ni Sepharose? 6Fa