快速检测微量赤藓红的试纸条及制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测微量赤藓红的试纸条及制备方法，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联赤藓红的载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的对照印迹；赤藓红金标抗体为胶体金标记的赤藓红单克隆抗体或多克隆抗体，偶联赤藓红的载体蛋白溶液为赤藓红与载体蛋白偶联的复合溶液。本发明的试纸条具有特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，易于推广应用。
【专利说明】快速检测微量赤藓红的试纸条及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测微量色素技术，特别是涉及一种快速检测微量赤藓红的试纸条及制备方法。
技术背景
[0002]赤藓红(ErythiOSin),又称樱桃红、四碘荧光素、食品色素3号，分子式为C20H6I4Na2O5.H2O,常见红色或红褐色颗粒或粉末，无臭，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇和甘油，不溶于油脂，耐热性、耐碱性、耐氧化还原性好，耐细菌性和耐光性差，遇酸则沉淀，吸湿性差。赤藓红具有良好的染着性，特别是对蛋白质的染着性尤佳。根据其性状，在需高温焙烤食品和碱性及中性食品中着色力较其他合成色素强。联合国粮农组织和世界卫生组织规定，赤藓红的每日允许摄取量为0-1.25mg/kg ;我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)规定:用于调味酱时赤藓红的最大使用量0.05g/kg ;用于高糖果汁(味)或果汁(味)或果汁(味)饮料、碳酸饮料、配制酒、糖果、糕点上彩装、青梅最大使用量0.05g/kg ;用于红绿丝、染色樱桃(系装饰用)的最大用量0.10g/kg。
[0003]目前国内外测定赤藓红在食品中残留的方法种类较多，主要是采用理化分析方法，包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)、气相色谱/质谱联用分析法(GC/MS)等，这些方法检测赤藓红的灵敏度高，特异性强，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间；同时这些检测方法需要大型专门仪器设备和专业技术人员操作，无法现场检测，时效性差，难以推广。免疫学检测法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程相对简单，用作赤藓红的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术，急待研究解决。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题:提供一种特异、灵敏、快速、简便的快速检测微量赤藓红的试纸条；
还提供一种检测微量赤藓红试纸条的制备方法。
[0005]本发明的技术方案:
一种快速检测微量赤藓红的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，吸附层上设有保护层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联赤藓红的载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的对照印迹。
[0006]所述偶联赤藓红的载体蛋白溶液是通过以下方法得到的:
采用DCC法将赤藓红与载体蛋白进行偶联，具体步骤如下:准确称取2mg的赤藓红、2mg的N，N’ - 二环己基碳二亚胺和5mg的N-羟基琥珀酰亚胺，溶于1.0mL N, N- 二甲基甲酰胺溶液中，室温避光搅拌4h，充分反应后得到A液；称取BSA IOmg溶于3mL PBS缓冲液中，得到B液；在室温磁力搅拌下，将A液缓慢加入B液中，4°C反应12h后用PBS透析3天，换液3次/天,透析完成后，4000rpm离心5min,取上清液,得到偶联赤藓红的载体蛋白，I&藏于-20°C，备用。
[0007]所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制成。
[0008]金标抗体纤维层用吸附赤藓红的金标抗体玻璃纤维棉制成，金标抗体为胶体金标记的赤藓红单克隆抗体或多克隆抗体，偶联赤藓红的载体蛋白溶液为赤藓红与载体蛋白偶联的复合溶液。
[0009]纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料。
[0010]偶联赤藓红的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或血蓝蛋白KLH。
[0011]检测印迹与对照印迹的排列组合为“
【权利要求】
1.一种快速检测微量赤藓红的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，吸附层上设有保护层，其特征是:吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联赤藓红的载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的对照印迹。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:所述偶联赤藓红的载体蛋白溶液是通过以下方法得到的: 采用DCC法将赤藓红与载体蛋白进行偶联，具体步骤如下:准确称取2mg的赤藓红、2mg的N，N’ - 二环己基碳二亚胺和5mg的N-羟基琥珀酰亚胺，溶于1.0mL N, N- 二甲基甲酰胺溶液中，室温避光搅拌4h，充分反应后得到A液；称取BSA IOmg溶于3mL PBS缓冲液中，得到B液；在室温磁力搅拌下，将A液缓慢加入B液中，4°C反应12h后用PBS透析3天，换液3次/天,透析完成后，4000rpm离心5min,取上清液,得到偶联赤藓红的载体蛋白，I&藏于-20°C，备用。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制成。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:金标抗 体纤维层用吸附赤藓红的金标抗体玻璃纤维棉制成，金标抗体为胶体金标记的赤藓红单克隆抗体或多克隆抗体，偶联赤藓红的载体蛋白溶液为赤藓红与载体蛋白偶联的复合溶液。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料。
6..根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:偶联赤藓红的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或血蓝蛋白KLH。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:检测印迹与对照印迹排列组合为“II ”、“ + + ”、“11”、“丁丁”、“ h P’中的一种；在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧约0.5cm处。
8.权利要求1所述赤藓红试纸条的制备方法，其特征是:该方法包括以下步骤: (1)偶联赤藓红载体蛋白的制备 采用DCC法将赤藓红与载体蛋白进行偶联，具体步骤如下:准确称取2mg的赤藓红、2mg的N，N’ - 二环己基碳二亚胺和5mg的N-羟基琥珀酰亚胺，溶于1.0mL N, N- 二甲基甲酰胺溶液中，室温避光搅拌4h，充分反应后得到A液；称取BSA IOmg溶于3mL PBS缓冲液中，得到B液；在室温磁力搅拌下，将A液缓慢加入B液中，40C反应12h后用PBS透析3天，换液3次/天,透析完成后，4000rpm离心5min,取上清液,得到偶联赤藓红的载体蛋白，I&藏于-20°C，备用； (2)抗赤藓红抗体的制备； (3)赤藓红金标抗体的制备； (4)羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体的制备； 用所得的赤藓红载体蛋白溶液在纤维素膜层上印制检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体在纤维素膜层上印制对照印迹；用赤藓红金标抗体制备金标抗体纤维层，然后依次按支撑层、吸附层和保护层的顺序组装成试纸条。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是:所述赤藓红金标抗体的制备方法如下: 沸腾的200mL 0.01-0.02%氯金酸溶液中加入新藓配制的I %柠檬酸钠8mL，获得直径15-20nm的胶体金溶液，用0.lmol/L的K2CO3调节pH值至8.5-9.5，置2-8°C保存，备用; 以1:2000的标记比将待标记的赤藓红的单克隆抗体或多克隆抗体加入pH 8.5-9.5的金溶胶中，标记IOmin后，加入20 %的PEG10000至终浓度为0.05 %，4°C、1500-3000rpm离心20min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、15000rpm离心Ih,弃上清,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得胶体金标记的赤藓红抗体。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是:所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体纤维层用吸附赤藓红的金标抗体玻璃纤维棉制成；偶联赤藓红的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或血蓝蛋白 KLH。
【文档编号】G01N33/544GK103454421SQ201310334330
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月3日 优先权日:2013年8月3日
【发明者】张改平, 邢广旭, 刘珍, 王栋, 胡骁飞, 王方雨, 赵东 申请人:河南百奥生物工程有限公司, 河南省农业科学院