专利名称：盐酸克伦特罗快速检测试纸条(ii)的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测受体兴奋剂的器具，特别是涉及一种盐酸克伦特罗(clenbuterol CL)快速检测试纸条(II)。
背景技术：
现代畜牧业为人类提供了极其丰富的肉、禽、奶、蛋等营养价值高、品质优良的各种食品，为人类的物质生活，提高人们健康水平，延长人类寿命做出了很大贡献。与此同时，现代科学研究证明，由于畜牧业现代化，大量使用饲料添加剂以及防病、治病需要，大量使用抗生素、激素以及其它合成药物，造成畜禽食品中药物残留，激素残留等。通过食物链的传递，药物残留和激素残留物质对人体健康和生命构成威胁和危害，如癌症人发病率增加，人类生育畸形比例增大，人体抗药性增强，青少年性早熟，中老年心血管疾病蔓延以及某些食物中毒等问题。往往与畜禽食品种的药物残留、激素残留密切相关。如盐酸克伦特罗(Clenbuterol)缩写为CL，俗称瘦肉精，是一种人工合成的肾上腺素神经兴奋剂，属β-兴奋剂类激素药物。低剂量时主要用于防治人、畜的支气管哮喘和支气管痉挛，肺气肿等疾病，但应有严格的剂量限制。用量超标人体会产生心悸、呕吐、肌肉不自主震颤等症状，甚至有生命危险，长期过量摄入会积蓄中毒，还有导致染色体畸变的可能。因其具有提高肌肉力量作用，很早就有一些运动员非法使用该药，国际上早就禁止在饲料和畜牧生产中使用。若剂量增加到治疗量的5～10倍，则有使胴体的脂肪重新分布，促进蛋白质合成和促进生长作用。所以增被用作畜禽饲料添加剂，添加到猪、牛、羊、兔、鸭、鹅等畜禽饲料中，以降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率，促进生长，人在食用含有CL残留的畜禽肉、蛋、奶食品时，容易发生食物中毒事件。因此，欧美各国均禁止CL作为生长促进剂和饲料添加剂使用。我国农业部也正式下文严禁CL作为饲料添加剂使用。但是某些畜禽饲养户及养殖场在经济利益的驱动下，暗地里非法使用CL做为饲料添加剂，如用含有CL饲料饲养的猪，由于瘦肉率高，对顾客具有强大的吸引力，使其欺骗性和危害性更大，严重威胁人类健康。同时CL等β-兴奋剂类药物也被国际奥委会公布为违禁药物。
当前对CL常用的检测方法主要有色谱技术和酶联免疫吸附试验等。色谱技术是国际上用于CL检测的常用经典技术，包括高效液相色谱(HPLC)，液相色谱/质谱连用(LC/MS)，气相色谱/质谱连用(GC/MS)，气相色谱/傅立叶红外联用(GC/FTIR)等。目前香港及内地研究单位多采用GC/MS和HPLC技术进行动物组织和毛发中CL的残留检测，应该说色谱技术对CL检测是非常有效、准确、敏感的。但待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间；另外这种检测方法还需要价格昂贵的仪器设备，且需专业人员操作，每次只能检测一个样品，严重阻碍了这种检测方法的普及推广，更无法实现现场检测。ELISA，也是一种常用检测技术，已有商品化的试剂盒出售。是以竞争性酶联反应为检测原理，以β-兴奋剂抗体包被酶标板，检测时将被检样品和酶标结合物同时加入酶标板，反应后显色测OD值，OD值愈低表示被检样品中含CL含量愈高。检测全过程约需2-4小时。ELISA一次可检测多个样品，即可定性检测，也可定量检测。但存在着假阳性或假阴性问题。由于ELISA是一种敏感性很强的技术，不同人操作往往会出现不同结果，对结果的判定需要有一定操作经验的专业人员，所以该检测方法也常常造成人为的误检和漏检。同时，β-兴奋剂的种类较多，各药物之间也存在一定的抗原性差异，这也是造成漏检原因之一，加之检测时间较长，很难实施现场检测。
当人们食用了残留较高浓度的CL动物组织后，会出现心动过速，肌肉震颤，心悸和神经过敏等症状。例如1997年上半年，在我国香港17人食用含有CL的猪肺汤，出现手指震颤、头晕、心悸、口干、失眠、瘫痪等症状，引起香港特别行政区和我国政府高度重视。浙江、北京、广东、河南等地也发现多人由于吃残留克伦特罗(CL瘦肉精)的猪肉造成食物中毒，引起农业部和当地政府的高度重视。各级食品检验部门和外贸出口单位，都加强对GL检测力度，以确保人民吃上放心肉。因此科技人员研制灵敏、快速，准确的CL检测方法，检测家畜组织及饲料中是否含CL的残留有着十分重要的意义。
(三)实用新型内容本实用新型目的是研制出特异、敏感、快速、简便的盐酸克伦特罗快速检测试纸条(II)。
本实用新型的技术方案是一种盐酸在伦特罗快速检测试纸条(II)，含有支撑层，反应试剂吸附层，支撑层为不吸水薄片层，吸附层固定在支撑层上，吸附层从样品端依次为纤维层，吸附藕联CL的金标载体蛋白Xi纤维层，纤维素膜层，手柄端为吸水材料层，在纤维素膜层上有含CL单克隆或多克隆抗体的检测印迹“|”和有含抗载体蛋白Xi抗体的对照印迹“|”。
不吸水的支撑层可用硬质塑胶片条，或不吸水硬纸条，纤维层可用玻璃棉，吸水材料层可用吸水纸，纤维素膜层可用硝酸纤维素膜，藕联CL的金标载体蛋白Xi为胶金标记的藕联CL的载体蛋白Xi，在玻璃棉和藕联CL的金标载体蛋白Xi玻璃棉，及吸水层上履盖有保护膜，在玻璃棉与藕联CL的金标载体蛋白Xi玻璃棉偏向玻璃棉一侧约0.5cm处印制样品标记线。
藕联CL的载体蛋白Xi可为牛血清白蛋白(BSA)X1，或为鸡卵清蛋白(OVA)X2，或为铁蛋白X3，或为血蓝蛋白X4等，在纤维素膜层上的检测印迹和对照印迹组合排列可为“‖”。本实用新型的有益的积极效果，CL快速检测试纸条(II)具有下列各项优点(1)特异性强，敏感性高。CL快速检测试纸条(II)以胶体金标记藕联CL的载体蛋白Xi为基础制备而成，金标载体蛋白Xi中金颗粒与载体蛋白Xi分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对抗体与CL的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条(II)具有较高的特异性和敏感性，可检测到0.1纳克。
(2)操作简便快速。使用快速检测试纸条(II)时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品10秒左右，在2分钟内即可判定检测结果。
(3)显示检测结果形象、直观、准确。快速检测试纸条(II)以显示红棕色“|”及“‖”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“|”印迹表示在被检测样品液中含有CL，两条棕红色“‖”印迹表示在被检样品中不含CL，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条(II)，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
(5)易于大范围推广应用。快速检测试纸条(II)操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图1.为盐酸克伦特罗快速检测试纸条(II)结构示意图。
图2.为盐酸克伦特罗快速检测试纸条(II)俯视结构示意图。
(五)具体实施例要制成盐酸克伦特罗快速检测试纸条(II)，首先需制备藕联CL的载体蛋白Xi，用于制备藕联CL的金标蛋白Xi玻璃棉，进而制备CL的单克隆抗体或多克隆抗体，用于印制检测印迹“|”，其次需制备羊或兔抗载体蛋白Xi抗体，用于印制对照印迹。
(1)CL与载体蛋白(Xi)的藕联采用碳化二亚胺法、重氮化法或戊二醛法，将CL与载体蛋白Xi进行藕联制备免疫抗原。将5mg盐酸克伦特罗溶解于预冷(2-8℃)的稀盐酸(pH3.0)中，加入10mg亚硝酸钠(重量比为2∶1)，室温避光搅拌6小时，溶液颜色变为黄色。将载体牛血清白蛋白，或鸡卵清蛋白或为铁蛋白，或血蓝蛋白溶于PBS缓冲液中，按摩尔比25∶1加入上反应中，温室搅拌过夜，将反应液用PBS缓冲液透析即可。
(2)抗CL单克隆抗体(W1)及多克隆抗体的制备以50μg-100μg/只的藕联CL的载体蛋白免疫BALB/c系小鼠三次，每次间隔15-30天；第三次加强免疫后3-4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％酒精浸泡5-10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与2-5×107的NSO浆细胞瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃的水溶中缓缓加入0.7-1ml的40％-50％PEG4000(PH8.5-9.0)作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100μl-200μl)孔，置37℃5％CO2培养箱中培养。培养7-10天后，以5μg-10μg/ml的藕联CL的载体蛋白包被酶标板(40孔/块)，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆(OD492＝0.8以上)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92-98，其分泌的单克隆抗体(W1)特异地与CL反应，而不与其它蛋白发生交叉反应，亲和力常数达109-10，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1IgG2aIgG2bIgG3，针对CL特异抗原决定簇的单克隆抗体(W1)，CL多克隆抗体的制备，按常规方法进行，此处不再重述。
(3)藕联CL的金标载体蛋白Xi玻璃棉的制备以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在沸腾的50-100ml 0.01-0.05％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L K2CO3调胶体金PH至8.5-9.5，以1∶1000～1∶1300的标记比将待标记的藕联CL的载体蛋白Xi加入pH8.5-9.5金溶胶中，标记10min后，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃ 1500-3000g离心20min，除去未结合的金颗粒，4℃15000g离心1h，弃上清，获初步纯化金蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白Xi，获得胶体金标记的藕联CL的载体蛋白Xi。将1∶100～1∶1500稀释的胶金标记藕联CL的载体蛋白Xi吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备CL的金标载体蛋白Xi玻璃棉。
(4)抗载体蛋白Xi抗体的制备以50μg～100μg/kg体重的纯载体蛋白Xi加免疫佐剂经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3～4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清，以饱和硫酸铵提取制备羊或兔血清IgG，取1份羊或兔血清加2份PBS(7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h，4℃1200r/min离心15min，弃上清；以适量PBS(7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃ 1200r/min离心15min，弃上清；以少量PBS(7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(7.2)过液透析，换液2～3次，4℃ 1200r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，冰箱保存备用。
(5)CL快速检测试纸条(II)实施检测反应原理当CL快速检测试纸条(II)样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检CL及藕联CL的金标载体蛋白Xi一起向硝酸纤维素膜扩散，则待检CL通过竞争结合原理抑制了藕联CL与纤维素膜上CL抗体检测印记结合，不能显示检测印迹，而抗载体蛋白Xi抗体能与藕联CL的金标载体蛋白Xi结合，形成红棕色对照印迹“|”，即一条红棕色“|”印迹为阳性标记，反之样品溶液中无CL则不能阻止藕联CL与纤维素膜上CL抗体检测印记结合，显示红棕色检测印迹“|”，同样抗载体蛋白Xi抗体能与藕联CL的金标载体蛋白Xi结合，显示红棕色对照印迹“|”，形成两条红棕色“‖”阴性标记。如果纤维素膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。
(6)盐酸克伦特罗(CL)快速检测试纸条(II)检测实例操作方法检测样品液的制备，若检测肉或肉制品可将样品剪碎、研磨，以生理盐水制成1∶2～1∶10待检测样品悬液，如果检测的对象是蛋或奶，可直接将蛋或奶用生理盐水制成1∶2～1∶10待检测样品悬液。
若用动物的血液作为待测样品，则提取血清，用血清作为待测样品，或直接取动物的尿液作为检测样品。
将CL快速检测试纸条(II)样品端插入待检测样品液中，插入深度不超过标记线9，约10秒后取出检测试纸条(II)，水平放置约2分钟，观察结果。
检测结果判断如果在纤维素膜上有一条红棕色标记“|”显示，表示检测结果呈阳性，说明在被检测的样品液中含有盐酸克伦特罗，即该动物饲喂过含有违禁的盐酸克伦特罗(CL)添加剂饲料，这样的动物肉和肉制品是不能在市场上流通的，人吃了上述肉将发生食品中毒，影响健康。
如果CL快速检测试纸条上的纤维素膜出现有两条红棕色标记“‖”，表示检测结果呈阴性，即在待检样品中不含盐酸克伦特罗成份，则呈阴性结果的动物肉和肉制品中不含CL成份，其食用是安全的。
实施例一，参见图1，图2，图中，1为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为样品端的纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附藕联CL的金标载体蛋白Xi纤维层，根据上述实施例(3)制备方法，制备吸附藕联CL的金标载体蛋白Xi玻璃棉，简称CL金标玻璃棉，4为纤维素膜层，本实施例采用硝酸纤维素膜，5为吸水材料层即手柄端用滤纸制成，将编号2，3，4，5各层从左至右粘贴在塑胶薄片条1上，在硝酸纤维素膜层4上，6为含有CL抗体检测印迹“|”，另外，7为含有用羊或兔抗载体蛋白Xi抗体在硝酸纤维素膜4上的对照印迹“|”，两个印迹并排形成组合印迹“‖”。8-1为白色保护膜，覆盖在玻璃棉2和吸附有藕联CL的金标载体蛋白Xi棉上，在2和3交界处对应保护膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一方0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，滤纸层5即吸水层(手柄端)上覆盖有黄色保护膜8-2。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，详见具体实施例中的(6)，这里就不重述了。
权利要求1.一种盐酸克伦特罗快速检测试纸条(II)，含有支撑层，反应试剂吸附层，支撑层为不吸水薄片层，吸附层固定在支撑层上，其特征是吸附层从样品端依次为纤维层，吸附藕联CL的金标载体蛋白Xi纤维层，纤维素膜层，手柄端为吸水材料层，在纤维素膜层上有含CL单克隆抗体W1或多克隆抗体的检测印迹“|”和有含抗载体蛋白Xi抗体的对照印迹“|”。
2.根据权利要求1所述的试纸条(II)，其特征是不吸水的支撑层可用硬质塑胶片条，或不吸水硬纸条，纤维层可用玻璃棉，吸水材料层可用吸水纸，纤维素膜层可用硝酸纤维素膜，藕联CL的金标载体蛋白Xi为胶金标记的藕联CL的载体蛋白Xi，在玻璃棉和藕联CL的金标载体蛋白Xi玻璃棉及吸水层上履盖有保护膜，在玻璃棉与藕联CL金标载体蛋白Xi玻璃棉偏向玻璃棉一侧约0.5cm处印制样品标记线。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条(II)，其特征是藕联CL的载体蛋白Xi可为牛血清白蛋白(BSA)X1或为鸡卵清白蛋白(OVA)X2，或为铁蛋白X3，或为血蓝蛋白X4等，在纤维素膜层上的检测印迹和对照印迹组合排列可为“‖”。
专利摘要本实用新型涉及一种检测受体兴奋剂的器具,特别是涉及一种盐酸克伦特罗快速检测的试纸条(II)。含有支撑层,反应试剂载体吸附层,支撑层为不吸水薄片条,吸附层固定在支撑层上,吸附层从样品端依次为纤维层,吸附藕联CL的金标载体蛋白Xi纤维层,纤维素膜层,手柄端为吸水材料层,在纤维素膜层上有含CL单克隆抗体Wi或多克隆抗体检测印迹“|”和有含抗载体蛋白Xi抗体的对照印迹“|”,组合印迹为“‖”。该快速检测试纸条(II),特异性强,敏感性高,操作简便快速,检测结果显示形象,直观,准确,成本低,投资少,不需专用仪器设备及专业人员,容易推广实施。
文档编号G01N33/558GK2515679SQ0222810
公开日2002年10月9日 申请日期2002年1月10日 优先权日2002年1月10日
发明者张改平, 李学伍, 王选年, 杨艳艳, 邓瑞广, 肖治军, 康晓笛, 郭军庆, 李青梅, 王爱萍, 杨继飞, 李灵霞 申请人:河南省农业科学院生物技术研究所