专利名称：一种牛奶中新霉素残留的一步elisa检测方法
技术领域：
一种针对牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，属于免疫分析化学技术领 域。
背景技术：
新霉素(neOmyCin，NE0)是由链霉素菌属弗氏链霉菌产生的多组分抗生素，含新霉 素B和C两种同分异构体(结构式如下所示)，但只有新霉素B具有抗菌活性。新霉素为水溶 性的碱性抗生素，市场上常用制剂为白色或类白色粉末状的硫酸新霉素，具有较强的吸湿 性，长期暴露在空气中会因为吸收水分而潮解。而新霉素本身具有极强的稳定性，对与酸， 碱，热等环境因素的耐受性明显强于其它抗生素。新霉素极易溶于水，但几乎不溶于乙醇、 乙醚、丙酮或氯仿等有机溶剂中，具有旋光活性。
权利要求
1.一种牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，其特征在于包括新霉素抗原的合成 与鉴定，新霉素抗血清效价的测定和新霉素抗血清特异性的检测；(1)新霉素抗原的合成利用戊二醛法合成新霉素免疫原和包被原；(2)新霉素免疫原的鉴定利用步骤(1)得到的新霉素免疫原，通过红外光谱法和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 凝胶电泳法SDS-PAGE对抗原进行鉴定；(3)制备新霉素抗血清利用步骤(1)得到的新霉素免疫原，通过免疫制备抗新霉素抗血清，即新霉素抗体；(4)新霉素抗体效价的测定利用步骤(3)得到的新霉素抗体，利用新霉素包被原包被酶标板，通过间接ELISA法测 定新霉素抗体的效价；(5)新霉素抗体特异性的测定利用步骤(3)得到的新霉素抗体，根据步骤(4)所得新霉素抗体的效价和最适工作浓 度，利用一步ELISA法检测新霉素抗体的特异性。
2.根据权利要求1所述的牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，其特征在于新霉 素抗原免疫原和包被原的合成①称取80mg新霉素NE0，40mg牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA溶于10 mL、0. 01 mol/L的磷酸盐缓冲液中；②充分溶解后逐滴加入1.5mL质量浓度1%戊二醛溶液，室温搅拌反应30 min ；③加入112mg NaBH4,4°C冰箱中静置Ih ；④反应液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析3天，间隔他换液；所得NEO-BSA偶联物为免疫原，所得NEO-OVA偶联物为包被原。
3.根据权利要求1所述的牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，其特征在于利用 红外光谱法进行新霉素免疫原的鉴定①分别称取NEO标准品，BSA和NEO-BSA样品各2mg ；②分别加入干燥的溴化钾KBr200 mg，混合物置于玛瑙研钵中，在红外灯照射下混勻、 充分研磨；③装入压片模具，在10吨压力下压片10min，制得厚度1 mm的透明KBr药品压片；④分别制取相应的KBr-NEO，KBr-BSA,及KBr-NEO-BSA3块样品压片，随后上红外光 谱仪测试鉴定。
4.根据权利要求1所述的牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，其特征在于利用 SDS-PAGE凝胶电泳法进行新霉素免疫原的鉴定①分离胶10%，浓缩胶5%，电压100V，电流20mA，电泳时间1.5h ；②固定液为12.5%的三氯乙酸溶液，固定30min ；③含0.1%考马斯亮蓝G250的固定液染色Ih ；④超低分子量标准蛋白分子量分别为兔肌球蛋白200000、钙调蛋白130000、兔磷酸 化酶B 97400、牛血清白蛋白66200、兔肌动蛋白43000 ；将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，获得一条标准曲线；⑤当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率和它的分子 量的对数呈线性关系，符合下式log(Mw)=k-bXRf，式中Mw为蛋白质分子量，&为迁移率， k、b均为常数，将未知分子量的待测蛋白质在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，根据它的电 泳迁移率在标准曲线上求得其分子量。
5.根据权利要求1所述的牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，其特征在于制备 新霉素抗血清，并进行新霉素抗体效价的测定①包被将新霉素包被原NEO-OVA用包被缓冲液作系列梯度稀释后加入96孔酶标板 中包被，100 yL/孔，于4 °C冰箱过夜，次日取出酶标板回至室温，甩干，每孔注入200 μ L 0. 01mol/L PBST溶液作为洗涤液，水平摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍 干，重复洗涤3次，以下洗涤方法相同；②封闭充分洗涤后，加入0.OlM的PBST封闭液封闭酶标板，200 1117孔，于371烘箱 内温育池后，重复洗涤3次，放入烘箱中IOmin烘干后取出待用；③竞争将抗新霉素阳性抗血清稀释系列梯度，对应加入到酶标板7行，第8行加入阴 性血清，100 μ L/孔，37 °C孵育30min后洗涤、拍干；④加二抗每孔加入100111^，1:3000稀释的酶标二抗!11^-186，37 °C烘箱中孵育30 min后洗涤、拍干；⑤显色每孔加入100μ L显色液，TMB与底物缓冲液体积配比为1:5，37 ！烘箱暗处 反应15 min ；⑥终止取出后每孔加入100μ L终止液，即2 mol/L的硫酸，用酶标仪测定450nm处 的吸光值A45tl;选择阳性血清的A45tl值在1. 5-1. 9，同时与阴性血清的A45tl值差距最大的包被原稀释浓 度、抗体稀释浓度为最佳工作浓度；阳性血清的A45tl彡阴性对照孔的2. 1倍，并且A45tl大于0. 1，此时血清的稀释倍数即为 血清的效价。
6.根据权利要求1所述的牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，其特征在于利用 一步ELISA法进行新霉素抗体特异性的测定①包被取两条8孔的酶标板，以工作点检测所选择出来的最佳包被浓度对包被原进 行系列梯度稀释并进行包被，100 μ L/孔，设置两个对照，置于4°C冰箱保存过夜，PBST洗 液洗涤三次，每次3 min，拍干；②封闭以0.OlM的PBST封闭液封闭，200 μ L/孔，置于4°C冰箱保存过夜，PBST洗 液洗涤三次，每次3 min，拍干；③竞争第一排加抗体稀释液，第二排起分别加7个浓度的新霉素标准溶液，50μ L/ 孔，以工作点检测所选择最佳稀释浓度稀释抗体，50 μ L/孔添加，同时各孔均加入1:3000 稀释的酶标二抗，100 μ L/孔，于振荡器上充分振荡，37°C放置30 min，PBST洗液洗涤五次， 每次3 min，拍干；④显色加入显色液，底物缓冲液与TMB体积比5:1,100μ L/孔，37°C反应15 min ；⑤终止加终止液，2mol/L浓硫酸，100 μ L/孔，酶标仪上检测各孔吸光度；⑥求出各浓度的B/B0:B/B0=B征值/B0校正值；B校正值=Ab实测均值—Ab空白均值Β。《μι为新霉素标准品溶液添加浓度为0 ng/mL时的吸光值，即阴性对照孔的校正值； IC50为达到吸光值为最大吸光值Amax —半时所添加的的新霉素标准品浓度，以Bz^l为 纵坐标，以新霉素标准品溶液添加的系列梯度浓度的对数值为横坐标在EXCEL上作图，即 得新霉素的抑制标准曲线。
全文摘要
一种牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明采用戊二醛法将新霉素(NEO)与牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联合成新霉素抗原(免疫原NEO-BSA或包被原NEO-OVA)，利用红外光谱法和SDS-PAGE凝胶电泳法对NEO-BSA进行鉴定，通过免疫获得新霉素抗血清，并用间接ELISA法检测其效价，通过一步ELISA法对新霉素抗血清的特异性进行检测。本发明相对于间接竞争ELISA法，由于极大地缩短了新霉素抗体特异性的检测时间，并且具有很高的灵敏度，达到了简单、快速、灵敏的检测牛奶中的新霉素残留，可广泛的用于快速现场检测。
文档编号G01N27/447GK102128923SQ201010604438
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者匡华, 屈昌龙, 徐丽广, 徐乃丰, 王利兵, 胥传来, 马伟 申请人:江南大学