一种生防放线菌的发酵方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一种生防放线菌的发酵方法及应用，包括以下步骤：步骤(1)分别制备弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，弗吉尼亚链霉菌种子菌液菌量为1.2～1.5×105?6/mL，白浅灰链霉菌2～5×104?5/mL；步骤(2)向5L的发酵罐中加入发酵培养液，再加入步骤1)制备的弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液进行混合发酵培养获得混合发酵液，混合发酵液菌量为2?8×106?7；所述弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液体积比为1:2.2～3。本发明由于采用上述弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液体积比为1:2.2～3的比例关系，可以显示不同放线菌的混合发酵且二者繁殖生长速度均较快，能够较好的发挥其拮抗活性。
【专利说明】
一种生防放线菌的发酵方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生防放线菌的发酵方法及应用，属于生物发酵液制备和应用领 域。
【背景技术】
[0002] 放线菌是产生抗生素活性物质最多的一类微生物，迄今已知的抗生素中，有2/3是 由放线菌产生。放线菌产生的许多抗生素能够对植物病原菌产生很强的抑制杀灭作用。其 中许多抗生素已经用于防治农作物上的有害生物，如井闪霉素、春雷霉素等。
[0003] 近年来，利用拮抗微生物进行生物防治越来越受到各国科学家的重视，已逐渐成 为植物病害防治研究的一大趋势。放线菌是一类极其丰富的微生物资源，其中很多，尤其是 链霉菌属能产生多种抗生素类物质，用于植物病害防治有着广阔的前景。
[0004] 但是放线菌的发酵是一个非常复杂的过程，受到很多环境条件的影响，除了培养 基的碳氮比、微量元素影响之外，还受培养时间、pH、温度、通入空气气量等因素的影响。通 常在放线菌发酵的前期，是具体的生长阶段，营养物质被消耗、抗生素开始产生。在发酵中 期，抗生素产生迅速。到后期，抗生素增长缓慢，可能是由于菌体衰老、细胞开始自溶，发酵 液中终产物的积累或者其它有害代谢对菌体产生影响，因此开发出针对不同的生防菌选择 不同的发酵条件的优化是至关重要的。
[0005] 番茄最初称之为"狼桃"。果实营养丰富，具特殊风味。可以生食、煮食、加工制成番 茄酱、汁或整果罐藏。番茄是全世界栽培最为普遍的果菜之一。味甘、酸，性凉，微寒。能清热 止渴，养阴，凉血，归肝、胃、肺经。具有生津止渴，健胃消食，清热解毒，凉血平肝，补血养血 和增进食欲的功效。但是番茄生长过程白粉病、炭疽病、黑斑病发病严重，大量农药的使用， 导致果实农药残留超标。
【发明内容】
[0006] 本发明为了解决上述的技术问题是提供一种生防放线菌的发酵方法及应用。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种生防放线菌的发酵方法，特别是 涉及一种复合放线菌的发酵方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤（1)分别制备弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，弗吉尼亚链霉菌 种子菌液菌量为1 ? 2~1 ? 5 X 105^/mL;白浅灰链霉菌2~5 X 1044/mL;
[0009] 步骤(2)向5L的发酵罐中加入1-3L发酵培养液，再加入步骤1)制备的弗吉尼亚链 霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液进行混合发酵培养获得混合发酵液，混合发酵液菌 量为 2-8X106-7/mL。
[0010]上述弗吉尼亚链霉菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号为： CGMCC No. 10042。白浅灰链霉菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号为 CGMCC No.6352〇
[0011]本发明的有益效果是:本发明混合发酵显著提高发酵时间，且同时保持对病原菌 具有较好的拮抗活性。
[0012] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0013] 本发明如上所述一种生防放线菌的发酵方法，进一步，步骤(2)所述混合发酵培养 过程中，加入弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液的体积比为1:2.2~3。
[0014] 采用上述进进一步的有益效果是：由于采用上述弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅 灰链霉菌种子菌液体积比为1:2.2~3的比例关系，可以显示不同放线菌的混合发酵且二者 繁殖生长速度均较快，可以缩短至5天以内，且能够较好的发挥混合发酵液的拮抗活性，超 过该比例范围，两种菌可能由于存在互相竞争或抑制的作用在相同的培养条件下均难以达 到其最高的拮抗活性，即对病原真菌具有较高的抑菌活性。
[0015] 本发明如上所述一种生防放线菌的发酵方法，进一步，步骤（1)分别制备弗吉尼亚 链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液的条件是分别在AAD培养基中28 °C、250r/min摇床培养3 天，分别获得弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液。所述摇床培养过程中通入空气 气量为750~850m 3/h。
[0016] 本发明如上所述一种生防放线菌的发酵方法，进一步，所述AAD培养基包括可溶性 淀粉4 %，黄豆粉4%、葡萄糖2 %，酵母膏0.2 %，蛋白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙0.2 %、磷酸 二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %，余下为水，pH 6.8-7。
[0017] 本发明如上所述一种生防放线菌的发酵方法，进一步，步骤(2)混合发酵培养条件 是将弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌在发酵培养液中28°C、150r-200r/min，摇培5天，获得 混合发酵液。
[0018] 本发明如上所述一种生防放线菌的发酵方法，进一步，摇培过程中通入空气气量 为750~850m3/h，通气即通入空气，为了微生物生长提供足够的氧气。
[0019] 本发明如上所述一种生防放线菌的发酵方法，进一步，所述发酵培养液为可溶性 淀粉5%，甘油5%，黄豆粉5%、葡萄糖5%，酵母膏5%，蛋白胨5%，酵母膏5%，碳酸钙 0.2%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钠0.2%、硫酸镁0.2%、硫酸亚铁0.2%，余下为水，pH 6.9。
[0020] 采用上述进一步方案的有益效果是:采用上述特定的培养基配方可以显著提高混 合放线菌生长速度最快且能较好的发挥发酵液中活性物质对病原菌的拮抗活性。
[0021] 本发明如上所述一种生防放线菌的发酵方法，进一步，所述弗吉尼亚链霉菌拉丁 名为Streptomyces virginiae;所述白浅灰链霉菌拉丁名为Streptomyces albogriseolus〇
[0022] 本发明还提供一种生防放线菌的发酵方法制备的发酵液在防治番茄白粉病、炭疽 病、黑斑病及黄瓜枯萎病菌和黄瓜疫霉菌所致植物病菌中的应用。
【具体实施方式】
[0023] 结合以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用 于限定本发明的范围。
[0024] 实施例1
[0025]本发明一种生防放线菌的发酵方法，包括以下步骤：
[0026] 步骤（1)分别制备弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，弗吉尼亚链霉菌 种子菌液菌量为1.2 X 105,白浅灰链霉菌2 X 104;具体地分别在AAD培养基中28°C、250r/min 摇床培养3天，分别获得弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，所述摇床培养过程中 通入空气气量为850m3/h。
[0027] AAD培养基包括可溶性淀粉4%，黄豆粉4%、葡萄糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨5%， 酵母膏5%，碳酸钙0.2%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钠0.2%、硫酸镁0.2%，余下为水，pH 6.8〇
[0028]步骤(2)向5L的发酵罐中加入1发酵培养液，再加入步骤1)制备的弗吉尼亚链霉菌 种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液进行混合发酵培养获得混合发酵液，混合发酵液菌量为 2.2 X 106;所述弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液体积比为1: 2.5。具体 地，混合发酵培养条件是ADD培养基中28 °C、150r/min，摇培5天，获得混合发酵液;摇培过程 中通入空气的气量为850m3/h。
[0029] 上述发酵培养液包括可溶性淀粉5 %，甘油5 %，黄豆粉5 %、葡萄糖5 %，酵母膏 5 %，蛋白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙0.2 %、磷酸二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %、 硫酸亚铁0.2%，余下为水，pH 6.9。
[0030] 实施例2
[0031] 本发明一种生防放线菌的发酵方法，包括以下步骤：
[0032] 步骤（1)分别制备弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，弗吉尼亚链霉菌 种子菌液菌量为1.5 X 106/mL，白浅灰链霉菌5 X 105/mL;具体地分别在AAD培养基中28°C、 250r/min摇床培养3天，分别获得弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，所述摇床培 养过程中通入空气气量为850m 3/h。
[0033] 上述具体AAD培养基包括可溶性淀粉4%，黄豆粉4%、葡萄糖2%，酵母膏0.2%，蛋 白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙0.2 %、磷酸二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %，余下为 水，pH 7〇
[0034]步骤(2)向5L的发酵罐中加入2L发酵培养液，再加入步骤1)制备的弗吉尼亚链霉 菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液进行混合发酵培养获得混合发酵液，混合发酵液菌量 为2.8 X 107/mL;所述弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液体积比为1: 2.2~ 3。具体地，混合发酵培养条件是ADD培养基中28 °C、200r/min，摇培5天，获得混合发酵液;摇 培过程中通入空气气量为850m3/h。
[0035] 上述发酵培养液包括可溶性淀粉5 %，甘油5 %，黄豆粉5 %、葡萄糖5 %，酵母膏 5 %，蛋白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙0.2 %、磷酸二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %、 硫酸亚铁0.2%，余下为水，pH 6.9。
[0036] 实施例3
[0037] 本发明一种生防放线菌的发酵方法，包括以下步骤：
[0038] 步骤（1)分别制备弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，弗吉尼亚链霉菌 种子菌液菌量为1.2 X 105/mL，白浅灰链霉菌5 X 104/mL;具体地分别在AAD培养基中28°C、 250r/min摇床培养3天，分别获得弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，所述摇床培 养过程中通入空气气量为850m 3/h。
[0039]上述具体AAD培养基包括可溶性淀粉4%，黄豆粉4%、葡萄糖2%，酵母膏0.2%，蛋 白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙0.2 %、磷酸二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %，余下为 水，pH 6.8。
[0040] 步骤(2)向5L的发酵罐中加入3L发酵培养液，再加入步骤(1)制备的弗吉尼亚链霉 菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液进行混合发酵培养获得混合发酵液，混合发酵液菌量 为8X10 6/mL;所述弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液体积比为1:2.2。具 体混合发酵培养条件是ADD培养基中28 °C、150r/min，摇培5天，获得混合发酵液;摇培过程 中通入空气气量为750m3/h。
[0041] 所述发酵培养液包括可溶性淀粉5 %，甘油5 %，黄豆粉5 %、葡萄糖5 %，酵母膏 5 %，蛋白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙0.2 %、磷酸二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %、 硫酸亚铁0.2%，余下为水，pH 6.9。
[0042] 实施例4
[0043] 本发明一种生防放线菌的发酵方法，特别是涉及一种复合放线菌的发酵方法，包 括以下步骤：
[0044] 步骤（1)分别制备弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，弗吉尼亚链霉菌 种子菌液菌量为1.2~1.5 X 106/mL，白浅灰链霉菌2~5 X 105/mL;具体地分别在AAD培养基 中28°C、250r/min摇床培养3天，分别获得弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，所 述摇床培养过程中通入空气气量为750~850m 3/h。
[0045]上述具体AAD培养基包括可溶性淀粉4%，黄豆粉4%、葡萄糖2%，酵母膏0.2%，蛋 白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙0.2 %、磷酸二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %，余下为 水，pH 6.8。
[0046]步骤(2)向5L的发酵罐中加入2.5L发酵培养液，再加入步骤1)制备的弗吉尼亚链 霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液进行混合发酵培养获得混合发酵液，混合发酵液菌 量为5.2X106/mL;所述弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液体积比为1:3。 具体地，混合发酵培养条件是ADD培养基中28 °C、150r/min，摇培5天，获得混合发酵液;摇培 过程中通入空气气量为750m3/h。
[0047]所述发酵培养液包括可溶性淀粉5 %，甘油5 %，黄豆粉5 %、葡萄糖5 %，酵母膏 5 %，蛋白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙0.2 %、磷酸二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %、 硫酸亚铁0.2%，余下为水，pH 6.9。
[0048] 对比例1
[0049] 本发明一种生防放线菌的发酵方法，特别是涉及一种复合放线菌的发酵方法，包 括以下步骤：
[0050] 步骤（1)分别制备弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，弗吉尼亚链霉菌 种子菌液菌量为1.5 X 106/mL，白浅灰链霉菌2~5 X 105/mL;具体地分别在高氏一号液体中 28°C、250r/min摇床培养3天，分别获得弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，所述 摇床培养过程中通入空气气量为850m 3/h。
[0051]步骤(2)向5L的发酵罐中加入发酵培养液，再加入步骤1)制备的弗吉尼亚链霉菌 种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液进行混合发酵培养获得混合发酵液，混合发酵液菌量为 2.3 X 104/mL;所述弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液体积比为1:1.具体 地，混合发酵培养条件是高氏一号液体中28 °C、150r/min，摇培20天，获得混合发酵液;摇培 过程中通入空气气量为850m3/h。
[0052] 对比例2
[0053]本发明一种生防放线菌的发酵方法，特别是涉及一种复合放线菌的发酵方法，包 括以下步骤：
[0054] 步骤（1)制备弗吉尼亚链霉菌种子菌液，弗吉尼亚链霉菌种子菌液菌量为1.5 X 106/mL;具体地分别在高氏一号液体中28°C、250r/min摇床培养3天，获得弗吉尼亚链霉菌， 所述摇床培养过程中通入空气气量为850m 3/h。
[0055]步骤(2)向5L的发酵罐中发酵培养液，再加入步骤1)制备的弗吉尼亚链霉菌种子 菌液进行发酵培养获得发酵液，发酵液菌量为2.3 X 106/mL。具体地，发酵培养条件是高氏 一号液体中28°C、150r/min，摇培16天，获得发酵液;摇培过程中通入空气气量为850m 3/h。 [0056] 对比例3
[0057]本发明一种生防放线菌的发酵方法，特别是涉及一种复合放线菌的发酵方法，包 括以下步骤：
[0058] 步骤（1)制备白浅灰链霉菌种子菌液，白浅灰链霉菌种子菌液菌量为1.5 X 106;具 体地分别在高氏一号液体中28°C、250r/min摇床培养3天，获得白浅灰链霉菌的种子菌液， 所述摇床培养过程中通入空气气量为850m3/h。
[0059] 步骤(2)向5L的发酵罐中加入发酵培养液，再加入步骤1)制备的白浅灰链霉菌菌 液进行发酵培养获得发酵液，发酵液菌量为2.8 X 106。具体地，发酵培养条件是高氏一号液 体中28°(：、15(^/1^11，摇培15天，获得发酵液 ;摇培过程中通入空气气量为85〇1113/11。
[0060] 采用实施例1至4与对比例1至对比例3发酵液对番茄白粉病、炭疽病、黑斑病及黄 瓜枯萎病菌和黄瓜疫霉菌的抑菌实验。
[0061] 将实施例1至4与对比例1至对比例3得到的发酵液作为生测样品，以番茄白粉病、 炭疽病、黑斑病及黄瓜枯萎病和黄瓜疫霉病为供试菌。将发酵液与PDA培养基以1:9的比例 混合制成平板在中央分别接入供试菌的菌饼直径为5mm，并且以无菌水处理作为对照，培养 3d，采用十字交叉法测定抑菌圈直径，每个处理重复3次。PDA培养基成分为马铃薯200g，葡 萄糖 20g，琼脂 15-20g，水1000ml。
[0062] 实施例1至4与对比例1至对比例3制备的发酵液对番茄白粉病、炭疽病、黑斑病及 黄瓜枯萎病和黄瓜疫霉病抑制效果的实验结果见表1。
[0064] 以上结果显示，本发明混合发酵培养获得的发酵液具有较好的抑制作用，与对比 例相比，可以显著缩短发酵时间，可望制成生物农药，具有较高的经济和社会效益。
[0065] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种生防放线菌的发酵方法，特别是涉及一种复合放线菌的发酵方法，其特征在于， 包括以下步骤： 步骤（1)分别制备弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液，弗吉尼亚链霉菌种子 菌液菌量为1.2~1.5 X lO^VmL;白浅灰链霉菌菌量为2~5 X 1044/mL; 步骤(2)向5L的发酵罐中加入1-3L发酵培养液，再加入步骤1)制备的弗吉尼亚链霉菌 种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液进行混合发酵培养获得混合发酵液，混合发酵液菌量为 2 ~8X106-7/mL。2. 根据权利要求1所述一种生防放线菌的发酵方法，其特征在于，步骤(2)所述混合发 酵培养过程中，加入弗吉尼亚链霉菌种子菌液和白浅灰链霉菌种子菌液的体积比为1: 2.2 ~3〇3. 根据权利要求1所述一种生防放线菌的发酵方法，其特征在于，步骤（1)所述弗吉尼 亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液的条件是分别在AAD培养基中28°C、250r/min摇床培 养3天，分别获得弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌的种子菌液。4. 根据权利要求3所述一种生防放线菌的发酵方法，其特征在于，所述AAD培养基包括 可溶性淀粉4%，黄豆粉4%、葡萄糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨5%，酵母膏5%，碳酸钙 0.2 %、磷酸二氢钾0.2 %、氯化钠0.2 %、硫酸镁0.2 %，余下为水，pH 6.8-7。5. 根据权利要求1至4任一项所述一种生防放线菌的发酵方法，其特征在于，步骤(2)混 合发酵培养条件是将弗吉尼亚链霉菌和白浅灰链霉菌在发酵培养液中28°C、150r-200r/ min，摇培5天，获得混合发酵液。6. 根据权利要求5所述一种生防放线菌的发酵方法，其特征在于，摇培过程中通气量为 750 ~850m3/h。7. 根据权利要求5所述一种生防放线菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养液为可 溶性淀粉5 %，甘油5 %，黄豆粉5 %、葡萄糖5 %，酵母膏5 %，蛋白胨5 %，酵母膏5 %，碳酸钙 0.2%、磷酸二氢钾0.2%、氯化钠 0.2%、硫酸镁0.2%、硫酸亚铁0.2%，余下为水，pH 6.9。8. 根据权利要求1至4任一项所述一种生防放线菌的发酵方法，其特征在于，所述弗吉 尼亚链霉菌拉丁名为Streptomyces virginiae;所述白浅灰链霉菌拉丁名为Streptomyces albogriseolus〇9. 一种权利要求1至8任一项所述生防放线菌的发酵方法制备的发酵液在防治番茄白 粉病、炭疽病、黑斑病及黄瓜枯萎病菌和黄瓜疫霉菌所致植物病菌中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK105820974SQ201610191193
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】李立梅, 陈越渠
【申请人】原巍俊