利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法。
【背景技术】
[0002] 菊粉是一种天然的果聚糖，由D-呋喃果糖以β -2, 1糖苷键相连，其还原端连 接一个葡萄糖基，呈直链结构。富含菊粉的植物主要有菊芋、菊苣等，菊粉以其具有的益 生元等独特功能而近年来备受食品行业的关注，应用前景十分广阔。菊粉酶是能够水解 β-2, I-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶，按作用的方式主要分为内切酶和外切酶。外切型 菊粉酶水解菊粉可生产高纯度果糖，内切型菊粉酶则可水解菊粉生产低聚果糖，这两种物 质均可分别作为食品添加剂，也可进一步发酵生产酒精、有机酸等产品 [1]。菊粉酶的来源广 泛，自然界中的许多微生物都可以产生菊粉酶[2_3]。
[0003]目前，菊粉酶传统的生产方法一般采用微生物液态发酵。近年来，多有文献报道采 用固态发酵法生产菊粉酶[4_7]。在酶生产方面，固态发酵相比于液态发酵有很多的优势，如 产酶活性高、技术简单、成本低、能耗低、产废水少以及更高的产品回收率等。因此，固态发 酵更适合工业化生产，而且通过固态发酵制得的粗酶可以直接用于生物合成和生物转换酶 的来源。但是大多数的研究均以含菊粉植物菊芋、菊苣等作为碳源对菌株进行产菊粉酶的 诱导，导致使用菊粉生产酶的成本较高，不适合工业生产，如果可以寻找一种价廉易得的碳 源来得到酶活高的菊粉酶，则可以满足工业生产的需求。
[0004] 食品加工厂在生产过程中会产生大量的大蒜皮，这些大蒜皮在日常中使用率极 低，通常作为垃圾处理，全国每年废弃处理的大蒜皮达到20万吨，造成了大量的浪费，同时 也对环境造成了污染。
[0005] 发明人自行申请的申请号为201310691141.8 ;申请日为：2013年12月13日； 申请人为：大连民族学院；发明名称为：一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501及其培养 方法和应用的发明专利，涉及一株从自然界中分离出的微生物灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501，所述的灰平链霉菌 Streptomyces griseoplanus S501，已于 2013 年 9 月13日提交保藏。
[0006] 在上述专利申请中提及利用该微生物采用液态发酵法产内切菊粉酶，其产酶活力 可达 121. 62U/ml。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus (以下 称S. griseoplanus) S501固态发酵生产外切菊粉酶的方法。
[0008] 本发明是发明人在自行申请的申请号为201310691141.8的发明专利的基础上进 一步研究。发明人在实践中发现，液态发酵方法耗时、耗力，而且由于采用菊粉作为碳源，成 本高，不适合工业化生产，故而发明人试图改用固态发酵的方法生产内切菊粉酶，但是实验 中意外的发现采用发明人实验中的一种方法最终产物不是内切菊粉酶，而是外切菊粉酶， 而且外切菊粉酶酶活大幅度提高，达到了出乎预料的技术效果，具有显著的进步。外切菊粉 酶水解产物为高纯度果糖，是比蔗糖更为优秀的甜味剂、功能性食品原料和添加剂，而传统 方法生产的外切菊粉酶，酶活低、成本高，且工艺方法复杂，本发明恰恰克服了上述缺陷，提 供了 一种工艺简单、酶活高、成本低的生产外切菊粉酶的方法。
[0009] 本发明的技术方案如下：利用灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus S501固态 发酵生产外切菊粉酶的方法，该固态发酵方法包括以下步骤：将菌株S501冻干粉以无菌水 配成菌悬液，用无菌签子蘸取适量于选择培养基上，在28°C下培养3-5d，将孢子刮下，置于 无菌水中稀释至孢子菌悬液浓度为10 6cfu/mL，孢子菌悬液按8. 0?12. 0% (v/w)的接种量 接入固态发酵培养基中，所述的接种量是指孢子菌悬液体积（ml)与固态发酵培养基的质 量（g)的比例；于28°C静止培养3-6d ;待发酵结束后，以干重计，每克固态发酵培养基基质 加入5mL去离子水，振荡提取Ih,用纱布过滤，将滤液于4°C，转速8000rpm/min离心20min 得到含外切菊粉酶的上清液，将上清液按常规冷冻干燥法制得外切菊粉酶；
[0010] 所述的固态发酵培养基基质为麸皮，碳源为菊粉、大蒜皮粉、大蒜粉、洋葱粉、韭菜 粉、香蕉皮粉和玉米粉中的一种，优选大蒜皮粉，可达到出乎意料的效果，相比采用大蒜粉、 洋葱粉、韭菜粉、香蕉皮粉和玉米粉作为碳源，使用大蒜皮粉为碳源时，产物酶活分别较之 提高了 14. 22%、28· 44%、44· 23%、50· 55%和 20. 54%，优势相当明显。
[0011] 进一步的，培养条件为：孢子菌悬液按11. 6% (v/w)的接种量接入固态发酵培养 基中，发酵时间141h，期间翻曲3-4次，所得菊粉外切酶酶活最高可达到209. 63±0. 96U/g。
[0012] 在一个优选的实施方案中，所述的选择培养基由包括以下含量的组分组成：
[0013] 菊粉 20g/L KNO5 lg/L Κ2ΗΡ〇4·3Η,0 0.5g/L MgSO4-7H20 0.5g/L FeSO4-TH2O O.Olg/L 琼脂 20g/L 天然海水 500mL 去离子水 500mL
[0014] 所述的选择培养基pH为7. 2,于112°C高压灭菌20min。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述的固态发酵培养基由包括以下含量的组分组成：
[0016] 固态发酵基质麸皮833g/L 菊粉 83.3g/L
[0017] KNO3 0.83g/L K2HPO4-SH2O 0 42g/L MgS04-7H20 0.42g/L FeS04-7H20 0.0()8g/L 去离子水 IOOOmL
[0018] 将所述的固态发酵培养基于112°C高压灭菌20min。
[0019] 在另一个优选的实施方案中，所述的固态发酵培养基具体为：
[0020] 固态发酵培养基pH为8.0?9.0,固液比为1:1. 4?1.5,于121 °C高压灭 菌20min ;所述固液比即每Ig麸皮加入1. 4?I. 5ml溶液，该溶液具体由NH4N03、NaCl、 K2HPO4 WH2CKMgSO4 WH2CKFeSO4 ·7Η20和去离子水组成，每IL去离子水中含NH4NO3 0· 42? 0· 83g，NaCl 0· 42g，K2HPO4 · 3Η20 0· 42g，MgSO4 · 7Η20 0· 42g，FeSO4 · 7Η20 0· 008g，大蒜皮 粉与固态发酵基质麸皮的质量比为0.048?0. 1:1。
[0021] 发明人采用麸皮作为固态发酵的基质，将廉价易得的大蒜皮粉，大蒜粉，洋葱粉， 韭菜粉，香蕉皮粉和玉米粉作为碳源，诱导菌株S501产菊粉酶，尤其是在基质中添加大蒜 皮粉可显著提高外切菊粉酶活性，达到出乎意料的技术效果，这是因为外切菊粉酶是一种 诱导酶，需要含菊粉的植物作为碳源进行诱导，大蒜皮粉的组分中含有一定量的菊粉，因此 可以诱导产生外切菊粉酶，而且效果显著。
[0022] 进一步的，上述的固态发酵培养基具体为：固态发酵培养基pH为9. 0,固液比为 1:1. 4,于121 °C高压灭菌20min，所述固液比即每Ig麸皮加入I. 4ml溶液，每IL去离子水中 含 NH4NO3O. 42g，NaCl 0· 42g，K2HPO4 · 3H20 0· 42g，MgSO4 · 7H20 0· 42g，FeSO4 · 7H20 0· 008g， 大蒜皮粉与固态发酵基质麸皮的质量比为〇. 048:1。
[0023] 发明人发现不同氮源对菌株产外切菊粉酶酶活的影响不同，并对比了无机氮源和 有机氮源（添加量分别占固态发酵基质麸皮的〇. 1 %，保持培养基的其他组分不变），发现 无机氮源和有机氮源对菌株S501产酶活性影响差异显著。总体来说，无机氮源对产酶活性 提高是有明显的促进作用，而在无机氮源中，NH 4NO3对菌株S501提高产酶活性影响最为显 著，平均酶活性可达169. 92U/g。
[0024] 关于温度，温度是影响微生物菌株发酵的重要因素之一，不同产菊粉酶微生物菌 株均有其最适的产酶温度，发明人考察了菌株S501在不同温度下对产酶活性影响，结果发 现，在26?34°C范围内，菌株S501产酶活性差异明显。
[0025] 关于培养基的pH，固态发酵培养基中的pH可以影响菊粉酶的合成，通过调整 发酵培养基中所加的少量营养液的pH来间接调整，该营养液成分中含有NH 4N03、NaCl、 K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20 和 FeSO4 · 7H20,当 pH = 9· 0 时，酶活达到最高。
[0026] 关于固态发酵培养基的固液比，固液比是影响微生物菌株固态发酵的另一重要因 素。合适的固液比将利于菌株产酶活性。含水量过高会使基质粘结成团，影响氧气的传递 和发酵热的散失，含水量过低，则会导致营养物质不能充分溶解，而不能给微生物生长提供 适宜的水分和养分，当固