除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途，特别是涉及一种对除 草剂麦草畏具有耐受性的蛋白质、其编码基因及用途。
【背景技术】
[0002] 杂草可以迅速耗尽土壤中作物和其它目的植物所需要的有价值的养分。尽管目前 可以得到耐受除草剂草甘膦、草丁膦、2, 4-D和其它除草剂处理的转基因植物，但是还存在 空白区域，如所控制的杂草范围、开发额外的除草剂耐受性作物等。此外，耐受上述除草剂 的杂草的出现（尽管通常是局部的和可变的）造成了对额外或备选的杂草控制措施的需 要。
[0003] 已经证明耐受除草剂性状在商业上是有价值的，因此需要增加耐受其它除草剂的 植物和管理难以控制的杂草种类的选项，以避免过度依赖任何单一除草剂，尤其需要针对 环境友好的并且在控制杂草方面高度有效的除草剂而开发除草剂耐受性。麦草畏是有效 且环境友好的除草剂之一，其已经被农民使用40多年了，麦草畏可用于控制玉米、高粱、小 米、牧草、干草、牧场、甘蔗、芦笋、草皮和草籽作物中一年生和多年生阔叶杂草和几种窄叶 杂草；与此同时，麦草畏可以伤害许多商业作物和双子叶植物，如大豆、棉花、豌豆、马铃薯、 向日葵和油菜，上述作物/植物对于低水平的麦草畏都是特别敏感的。尽管如此，麦草畏在 控制杂草生长中仍然是有效的，并且是重要的。
[0004] 已报道从嗜麦芽假单胞菌（Pseudomonas maltophilia)分离了编码麦草畏单加氧 酶（DMO)的基因，其为铁氧还蛋白依赖型并赋予对麦草畏的耐受性。DMO参与将除草剂麦草 畏（3, 6-二氯-邻-茴香酸）转化为无毒的3, 6-二氯水杨酸（DCSA)，表达DMO基因的植物 具有对麦草畏的耐受性。
[0005] 由于目前发现的麦草畏耐受型基因均及其相似，所以需要更多新型的麦草畏耐受 型基因以避免过度依赖一种麦草畏耐受型基因，使麦草畏-麦草畏耐受型作物在商业上具 有更广阔的应用空间。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途，本发明旨在 提供一种新的DMT66基因，所述DMT66蛋白在植物中对麦草畏除草剂具有较高的耐受性。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种蛋白质，具有SEQ ID NO: 2所不的氣基酸序列 组成的蛋白质。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供了一种基因，包括：
[0009] (a)编码所述蛋白质的核苷酸序列；或
[0010] (b)在严格条件下与（a)限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或
[0011] (c)具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
[0012] (d)具有SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。
[0013] 所述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠）、0. 5% SDS (十二烷基硫酸钠）溶液中， 在65°C下杂交，然后用2XSSC、0. 1% SDS和1XSSC、0. 1% SDS各洗膜1次。
[0014] 为实现上述目的，本发明还提供了一种组合蛋白，包括至少由第一核苷酸序列和 第二核苷酸序列编码，所述第一核苷酸序列编码所述蛋白质。
[0015] 进一步地，所述第二核苷酸序列编码甲基四氢叶酸还原酶、甲酰四氢叶酸脱甲酰 酶和/或次甲基环化酶。
[0016] 更进一步地，所述甲基四氢叶酸还原酶具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，所述 甲酰四氢叶酸脱甲酰酶具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述次甲基环化酶具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0017] 优选地，所述第二核苷酸序列具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:9 所示的核苷酸序列。
[0018] 具体地，编码所述组合蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:26所示的核苷酸序列。
[0019] 更具体地，编码所述组合蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。 [0020] 为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控 下的所述基因或编码所述组合蛋白的核苷酸序列。
[0021] 进一步地，所述调控序列为叶绿体转运肽，所述叶绿体转运肽与所述基因有效连 接。
[0022] 优选地，所述叶绿体转运肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列。
[0023] 为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述基因、编码所述组合蛋白的核苷 酸序列或所述表达盒的重组载体。
[0024] 为实现上述目的，本发明还提供了一种增加耐受除草剂范围的方法，包括：将所 述蛋白质、所述组合蛋白或所述表达盒编码的蛋白质在植物中与至少一种不同于所述蛋白 质、所述组合蛋白或所述表达盒编码的蛋白质的第二种蛋白质一起表达。
[0025] 进一步地，所述第二种蛋白质为草甘膦耐受性蛋白质、草铵膦耐受性蛋白质、α 酮戊二酸双加氧酶、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉 原氧化酶。
[0026] 在本发明中，DMT66除草剂耐受性蛋白质在一种转基因植物中的表达可以伴随着 一个或多个草甘膦耐受性蛋白质和/或草铵膦耐受性蛋白质的表达。这种超过一种的除草 剂耐受性蛋白质在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所 需的基因来实现。另外，一种植物（第1亲本）可以通过遗传工程操作表达DMT66除草剂 耐受性蛋白质，第二种植物（第2亲本）可以通过遗传工程操作表达草甘膦耐受性蛋白质 和/或草铵膦耐受性蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2 亲本的所有基因的后代植物。
[0027] 为实现上述目的，本发明还提供了一种选择转化的植物细胞的方法，包括：用所述 基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所 述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的转化细胞生长，而杀死未转化细 胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞，所述除草剂为麦草畏。
[0028] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草的方法，包括：对种植植物的大田 施用有效剂量的麦草畏除草剂，所述植物包含所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列、 所述表达盒或所述重组载体。
[0029] 为实现上述目的，本发明还提供了一种保护植物免受由除草剂引起的损伤的方 法，包括：将所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列、所述表达盒或所述重组载体导入 植物，使导入后的植物产生足够保护其免受麦草畏损害量的除草剂耐受性蛋白质。
[0030] 为实现上述目的，本发明还提供了一种赋予植物麦草畏除草剂耐受性的方法，包 括：将所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列、所述表达盒或所述重组载体导入植物。
[0031] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦耐受 性杂草的方法，包括：对种植草甘膦耐受性植物的大田施用有效剂量的麦草畏，所述草甘膦 耐受性植物包含所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列、所述表达盒或所述重组载体。
[0032] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生麦草畏耐受性植物的方法，包括向所 述植物的基因组中引入所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒，以产生 麦草畏耐受性植物。
[0033] 具体地，所述产生麦草畏耐受性植物的方法包括：通过将亲本植物自交或与第二 种植物杂交而产生麦草畏耐受性植物，所述亲本植物和/或第二种植物包含所述基因、编 码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒，所述麦草畏耐受性植物遗传了来自所述亲本 植物和/或第二种植物的所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒。
[0034] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对麦草畏除草剂具有耐受性的植物的 方法，包括：
[0035] 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括所述基因、编码所述组合 蛋白的核苷酸序列或所述表达盒；
[0036] 使所述植物种子长成植株；
[0037] 用有效剂量麦草畏除草剂喷洒所述植株，收获与其他不具有所述基因、编码所述 组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的植株相比具有减弱的植物损伤的植株。
[0038] 在上述技术方案的基础上，优选地，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜 或甘蔗。
[0039] 为实现上述目的，本发明还提供了一种好氧型四氢叶酸依赖型的脱甲基酶耐受麦 草畏除草剂的用途。
[0040] 为实现上述目的，本发明还提供了一种菌株，其包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序 列，所述菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M2014550。
[0041] 将所述的基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明中为将外源 DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将 DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
[0042] 本发明可以增加植物对于氧化应激的耐受性，包括但不限于，向植物群提供麦草 畏或麦草畏单加氧酶所介导代谢的产物或其类似物，以改善植物的除草剂耐受性，例如，通 过将麦草畏代谢为DCSA。
[0043] 本发明"麦草畏"(Dicamba)是指3, 6_二氣-邻-茵香酸或3, 6_二氣_2_甲氧基苯 甲酸及其酸和盐。其盐包括异丙胺盐、二甘醇铵盐、二甲胺盐、钾盐和钠盐。麦草畏的商业制 剂包括但不限于，Banvel? (作为 DMA 盐）、Clarity? (BASF，作为 DGA 盐）、VEL-58-CS-ll? 和 Vanquish政：（BASF，作为 DGA 盐）。
[0044] 目前已经报道的含甲氧基芳烃化合物脱甲基酶有4种，分别是（l)RH〇S(Ri eSke 非血红素型氧化酶），降解麦草畏的DMO(GenBank:AY786443. 1)属于三组份RHO类型的 氧化酶；（2)细胞色素 P450,是一类亚铁血红素一硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物 质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢，很多含甲氧基芳烃化合物脱甲基 酶就是这一类型；（3)厌氧型四氢叶酸依赖型脱甲基酶，发现于厌氧细菌如热醋穆尔氏菌 (Moorellathermoacetica)中，参与木质素降解中间产物如丁香酸和香草酸的厌氧降解，也 有研宄发现厌氧型四氢叶酸依赖型脱甲基酶也可以厌氧降解麦草畏；(4)好氧型四氢叶酸 依赖型的脱甲基酶（Sphingomonas paucimobilis SYK-6)，参与木质素降解中间产物如丁 香酸和香草酸的厌氧降解，但目前还没有这类好氧型四氢叶酸依赖型脱甲基酶能降解麦 草畏的报道。
[0045] 本发明所述基因用于植物表达后具有允许在植物中使用麦草畏除草剂的特性，所 述植物中固有耐性不存在或不足以允许使用麦草畏除草剂。此外，本发明所述DMT66基因 可以在天然耐性不足以允许选择性时在植物中提供对麦草畏除草剂的防护。向田地使用的 施用量是大约〇. 0025