专利名称：外表面蛋白质及其基因和用途的制作方法
技术领域：
该项发明是关于外表面蛋白质的鉴定及其基因和用途，尤其是涉及 在免疫治疗和药物筛选上的应用。
背景技术：
B组链球菌(GBS)也被称为无乳链球菌，是各种病的病原体。特别是， GBS可引起
早期发作新生期感染
该感染通常开始于子宫，导致新生儿严重的败血病和肺炎，如果不 能及时治疗将其致死，即使得到治疗也会有10 - 20%的死亡率。 晚期发作新生期感染
该感染多发于嬰儿刚出生至大约3个月期间，可致败血病，90°/。的病 例伴发脑膜炎。其它病灶性感染包括脑膜炎、脓毒性关节炎、脓肿和眼 内炎。
成人感染
该感染似乎越来越常见且最频繁地发生于刚生育过婴儿的、年长的、 无免疫应答的女性身上。其特征为败血病和病灶性感染，包括脑膜炎、 脓毒性关节炎、脓肿和眼内炎。
尿道感染
GBSl泉道感染的成因，在妊娠期的所有感染中约占10%。 家畜感染
GBS引起奶牛的慢性乳腺炎。导致产奶量下降，因此具有值得注意的 经济重要性。
虽然GBS感染可用抗生素治疗，但免疫学的方法是优选的。因此人 们希望找到一种能被用于有治疗效果的疫苗中的免疫原。
3发明概要
本发明基于在GBS中的一系列基因的筌定，以及相关的生物体，该 生物体的产物可能与其外表面相关联且因此可被用作免疫治疗的乾.
根据本发明的一个方面，肽由包括任意的已被筌定为MS4、 MSIO、 MSll、 MS14和MS16的可得自GBS的基因，或其同源物或功能性片段的操 纵子所编码。此种肽适合用于治疗，例如当被分离后。
此处所用的术语"功能性片段"是指一部分保留整个基因或肽活性 的基因或肽。例如肽的功能性片段可用做抗原决定因子，在疫苗或抗体 生产方面颇有用处.
基因片段可用于编码活性肽，另外，该基因片段在基因疗法、体内 野生型基因定位来发挥治疗作用方面有实用.
本发明的肽可包含确定的任一氨基酸序列，如SEQ IDN0S.2、 4、 6、 8、 10和12，或包含上述序列的功能性片段。
因为位于细胞外或细胞表面的位置，本发明的肽可为生产抗GBS治 疗上有效的疫苗的候选物."治疗上有效的"是指包括疫苗的预防作用。 例如，疫苗可包含本发明所述的肽或用于其表达的工具以治疗感染。
这种疫苗可在妇女怀孕前或怀孕期间给药来保护母亲和新生儿免受 GBS感染.
根据本发明的另一方面，此肽或基因可用于筛选潜在的抗微生物药 物或毒性检测.
本发明的另一个方面是在此处鉴定的任意产物的用途，用于与GBS 菌抹感染相关病症的治疗或预防。
虽然已经描述了此蛋白质用于病人的治疗，但该产物的兽医用途也 被视为在本发明的范围之内。尤其是，该肽或疫苗可被用于慢性乳腺炎 的治疗，特别是对奶牛的治疗。
发明描述
本发明与B组链球菌菌抹M732有关，然而所有的GBS菌抹和许多其 它的细菌菌抹都可能包含相关的肽或蛋白质，它们都有与M732的肽同源的氨基酸序列。可能含有此肽的生物体，包括但不仅限于此肺炎链球 菌，酿脓链球菌，猪链球菌，米氏链球菌，C组和G组链球菌，还有肠球 菌。按照描述GBS的相同方法，可以开发出这些菌抹中的相应疫苗.
优逸地，用于生产疫苗的欣与在此筌定的肽有超过40%的序列相似 性，优选可以超过60%,最优选可多于80%的序列相似性，例如95%相似 性，
在筌定出本发明的一个基因后，可以用此基因序列在别的微生物中 确定同源性。以此方式还可以确定别的微生物是否有相似的外表面产物. 通it^现存的数据库例如EMBL或Genbank中搜索，可以确t亭列的同 源性。
本发明的肽或蛋白质可通过本领域已知的方法被纯化和分离。特别 是，确定基因序列后，可以用重组技术在合适的宿主中表达基因.活性 片段和同源物可以被鉴定出来，并在治疗领域中应用。例如，肽或其活 性片段可在疫苗中作为抗原决定簇，来引起免疫答应。其也可以被用于 抗体的制备，用于被动免疫或诊断应用.合适的抗体包括单克隆抗体或 其片段，包括单链fv片段。制备抗体的方法对本领域的技术人员来说是 显而易见的。
基于减毒微生物的疫苗的制备是本领域技术人员已知的。如需要或 希望的话，疫苗组合物可与合适的载体或佐剂如明矾一起配制，并用于 治疗，来提供抗B组链球菌或其它相关微生物的有效免疫作用.疫苗配 剂的制备对本领域的技术人员来说是显而易见的，
通常，本发明用于治疗的活性成分的合适的量以及合适载体或赋形 剂以及给药途径的选择对本领域的技术人员来说是公知的.这些因素可 根据已知标准选择或确定，诸如所治疗病症的性质/严重性、受治疗者的 类型或健康状况等.
本发明的产品可按如下方法鉴定
将GBS接种于Todd - H—ewitt氏链球菌肉汤培养基中，允许在37"C下 培养过夜.细胞被离心收集和用磷酸盐緩冲盐水(PBS)洗涤.将细胞重新悬浮在渗透性緩冲液(2096(W/V)蔗糖，20MmTris - HC1 pH 7.0, 10mMMgCl2) 中，该渗透性緩冲液含有蛋白酶抑制剂(lmM PMSF， IOMM碘乙酸，10mM 1,10-二氮杂菲，1mM胃酶抑素A)和终浓度为4单位/微升变溶菌素， 在37^培养(振荡)2小时。
先用高速离心机除去细胞和碎屑，再用超高速离心1小时。所得到 的含有细胞壁蛋白质的上清液用超滤设备加压浓缩(分子量截断值为 10,000).
样品对超高水透析后冻干，经过在填充緩冲液中再悬浮，用制备性 两向凝胶电泳分离出蛋白质，电泳后，选一个单独的点用于研究.对该 点进行MR内胰蛋白酶消化.皿状中提取产生的肽，用微内径RP-HPLC 纯化。每隔45秒收集一次级分，与紫外吸收区相应的部分用延时提取-基体辅助激光解吸-飞行时间质谱、(DE-MALDI-TOF-MS)分析.然后 用Nanospray - MS/MS对在空白制剂中未观察到的Jtt行测序。
使用此狀序列的信息，设计了简并低聚核苷酸，将其用于聚合酶链 反应(PCR)来扩增位于所筌定的Ji^列之间的DNA片段.
PCR扩增反应的结果是产生几个多聚核苷酸片段，其中每一片段按照 制造商的说明书被克隆到pCR 2. 1-TOPO载体(Invitrogen BV,荷兰) 中。
每一质粒中的DNA片段通过测序被鉴定，然后如下所述被用于获得 全长基因序列.
用已筌定的DNA片段，低聚核苷酸引物被设计用于基因組DNA测序. 这些引物被设计以便从得到的序列"向外的"方向排序。 一旦阅读，即 可检查获得的序列是否已经到达基因的5'端和3，端。通过检查同源序列 筌定了这些特征的存在，对于5'末端来说，在Shine - Dalgarno共有序 列之前存在AUG起始密码子(或公认的替换物)而对于3'末端来说，存在 翻译终止密码子。
根据全长基因的鉴定，引物被设计用于从GBS基因组DNA扩增全长 产物。所用的引物包括限制酶识别位点(在5'末端的Ncol和在3'末端的Eco0109D，允许产物随后克隆到所用的乳球菌表达体系中.
用引物进行PCR反应，并把产物克隆到pCR 2.1克隆载体 (Invitrogen)中.在确认克隆片賴:存在后，用限制酶Ncol和Eco01091 切除该亂
插入此片段的栽体是pNZ8048的修饰变体(Kuipers， 0. P.等人(1998) J.Biotech 64:15-21)。这种含有乳球菌复制起点、氯霉素抗性标记、 可诱导的乳链菌肽启动子和多克隆位点的载体通过用2个10X组氨酸标 记取代位点得以改变多克隆，側接于带有Ncol位点的5，末端，在含有多 克隆位点(包括Eco01091位点)和His标记的3'末端的终止密码子的中间 分开.
插入目的基因，这样一个10X组氨酸标记处在相对于密码区的3'位 置.把重组质粒转化到乳酸乳球菌(L. lactis)(菌抹NZ9000 - Kuipers， 0.p.等人(1998)见上文)中，形成一种400ml的液体培养物，通过将乳链 菌肽加到培养物中来诱导蛋白质的翻译.培养2小时后，收获细胞并用 玻珠搅打溶胞，将生成的溶胞产物离心分离，然后通过金属亲合性(Talon, clonetech)柱.在用咪唑洗脱结合的蛋白质前反复洗柱.
为了鉴定含有组氨酸标记的重组蛋白质的级分，每个级分的等分试 样都用SDS-PAGE、蛋白质印迹法分析，并用抗-His抗M测.
然后用得到的重组蛋白质免疫新西兰白兔，在免疫前收集免疫前血 清.在加强免疫之后，处死白兔，收集血清，用于蛋白质印迹法、ELISA 和动物保护模型.
使用获自动物研究的血清，进行免疫吸附研究。
B组链球菌在20ml Todd - Hewitt氏链球菌肉汤(THB)中培养8小时， 收集后再悬浮于5ml PBS中。在96孔平板(Nunc免疫-吸附)中，用50 Pl等分试样覆盖加样孔，在4t:放置过夜以吸收细菌到平板上。用GBS 洗平板两次，然后在37"C下用加入3%BAS的PBS封闭1小时。再次洗涤 平板。在PBS中制得连续10倍的血清稀释液且50 M 1稀释液被加到平板 的孔中， 一式两份.盖上平板并在37C培养1小时.洗涤平板，然后在
7每个孔中加入浓度为1:5000的50n 1抗M性磷酸酶缀合的第二抗体. 在37t:培养l小时后，再次洗涤平板.把50m1底物(PNPP)加入毎个孔， 在405咖处读取吸收度前反应30min.
进行动物保护研究，检验保护作用对免疫接种兔的有效性，
GBS M732在T朋中培养，直至对数中期，约需5小时，在计数室中 进行细胞计数，在免疫前或试验血清中稀释细菌浓度至2x107ml.取50 P 1通过 内途径注射入出生0- 1天的小鼠，在48小时内观察小鼠的 存活状况，
下面的实施例阐述了本发明.
实施例1
第一个质粒陂称为MS4。克隆的DNA片殺:被测序，核苷酸和推断的氨 基酸序列(SEQ ID NO. 1和2)被用于检索蛋白质数据库.
可在产气荚膜梭菌、流感嗜血菌、淡黄奈瑟氏球菌和Thermatoga maritima中鉴定GBS MS4基因产物的同源物。在所有的情况下同源物都 是鸟氨酸转氨甲酰酶(OCT)的基因.在真核体系中这种酶催化尿素循环的 第二步反应-鸟氨酸转化为瓜氨酸，该反应需氨甲酰磷酸.在原核生物 中，ODC是与精氨酸脱氨酶活性有关的三种酶之一-保护细菌不受酸侵 蚀。尤其，ODC有助于瓜氨酸转为鸟氨酸和氨甲晚磷酸(与真核生物中的 相反的作用)(Casiano—colon, A and Marquis, R. E. 1998. Ap pi. Environ. Microbiol. 54:1318- 1324, Cunin， R.等人1986. Microbiol. Rev. 50:314-352)。
如上所述进行了动物保护研究。结果如下
处理 幼犬数 在时间点(hrs)存活的幼犬数
24 48
PBS15 6 0
免疫前41 18 1
试验 41 33 14 实施例2
8第二个质M称为MSll.核苷酸和推断的tt酸序列(SEQ ID NOS. 3 和4)被用于检索蛋白质数据库.
GBS MS11基因产物的同源物可在德氏乳杆菌，海栖热袍菌，丙酮丁 醇梭菌，巨大芽孢杆菌，Tritic咖aestivi咖和集胞蓝细菌PCC6803中 被鉴定。
在所有的情况下同源物都是磷酸甘油激活酶(PGK)蛋白质的基因.PGK 是糖酵解途径中的主要酶，与甘油醛3-磷酸-转变为磷酸烯醇丙酮酸的 反应有关.尤其，与甘油酸-1,3-二磷酸与3-磷酸-甘油酸之间反应 的催化作用有关，在向前的反应中释放一个磷酸。
实施例3
第三个质敉陂称为pMS16。 5，和3'末端克隆DNA片段被测序且5，端 片段的核苷酸和推断的^^列被显示于SEQ ID NOS. 5和6, 3'端片 段的核苷酸和推断的g酸序列被显示于SEQ ID NOS. 7和8.
GBS MS16基因户物的同源物可以在嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆 菌和生殖道枝原体中被筌定。
在所有的情况下同源物都是编码葡萄糖_ 6 -裤酸异构酶(GPI)蛋白 质的基因。
葡萄糖-6 -磷酸异构酶催化糖酵解(G6P到F6P)和糖异生(F6P到G6P) 过程中的葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之间的反应，已证明gpi基 因中的突变赋予生物体嘌呤类似物敏感性.
实施例4
第四个质M称为pMS14。克隆的DNA片段被测序，核苷酸和推断的 氨基紗列(SEQ ID N0.9和IO)被用于检索蛋白质数据库。
GBS MS14基因产物的同源物可在嗜热脂肪芽孢杆菌，Mus musculus， Bos taurus和玉米中被筌定。在所有的情况下同源物均为嘌呤核苷磷酸 酶(PNP)蛋白质的基因。此酶的作用是在正磷酸存在时切割鸟嘌呤核苷或 肌苷成为其各自的碱基和糖-1 -磷酸分子.
实施例5第五个质M称为pMS10.克隆的DNA片^:被测序，核苷酸和推断的 氨基酸序列(SEQ ID NO. 11和12)被用于检索蛋白质数据库。
GBS MS10基因产物的同源物可在变异链球菌，Nicotiana Pl咖b， Pis咖sati v咖和玉米中被筌定.在所有的情况下同源物都是非磷酸化， NADP-依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NPGAP - 3 - DH)蛋白质的基因. NPGAP-3-DH已被报道作为在变异链球菌中产生NADPH用于生物合成反 应的重要工具(与符合糖酵解途径要求的NAD-特异性GAP-3-ffl相 反)(Boyd， D.A.， Cvitkovitch, D. G.和Hamilton, I.R 1995细菌学杂 志.177:2622-2727).序列表
<110> Microscience Limited
<12。>外表面蛋白质及其基因和用途 <130> REP05969WO
<140> <141>
<160> 12
<1*70> Patentln Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1014
<212> DNA
<213> B组链球菌
<220>
<221> CDS
<222> (1) * (1014)
<400> 1
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<212> PRT
<213> B组链球菌
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lie Ala l<eu Leu Phe Glu Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Ala Ala Phe 50 55 60
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115 120
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135
140
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Cys Gly Asp Gly. Arg Asn Asn Val Ala Asn Ser Leu Leu Val Ala Gly 165 170 175
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Xaa Ala Glu Glu lie Val Lys Leu Ala Glu Gly Tyr Ala Lys Glu Ser 195 200 205
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Ala Asp Val Phe Tyr Thr Asp Val Trp Val Ser Met Gly Glu Glu Asp 225 230 235 240
Lys Phe Lys Glu Arg Val Glu Leu Leu Gin Pro Tyr Gin Val Asn Met 245 250 255
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Sex: Lys Tyr Ala Arg His Phe Asp Gin Ala Glu Asn Arg Met His Thr 305 310 315 320
lie Lys Ala Val Met Ala Ala Thr Leu Gly Asn Leu Phe lie Pro Lys 325 330 335
Val
<210> 3
<211> 1197
<212> DNA
<213> B组链球菌
<220>
14<221> CDS
<222> (1) (1197)
<400> 3
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1008
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1056
ggt ggt ggt gat tea gca gca get get ate aac ctt ggt cgt get gac 1104 Gly Gly Gly Asp Ser Ala Ala Ala Ala lie Asn Leu Gly Arg Ala Asp 355 360 365
16aaa ttc tea tgg ate tct act ggt ggt gga gca age atg gaa ttg etc 1152 Lys Phe Ser Trp lie Ser Thr Gly Gly Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu 370 375 380
gaa ggt aaa gta tta cca ggt ttg gca gca ttg act gaa aaa taa 1197 Glu Gly Lys Val Leu Pro Gly Leu Ala Ala. Leu Thr Glu Lys 385 390 395
<210> <211> <212> <213>
4
398 PRT
B组链球菌
4 ' .
Met Ala Lys Leu Thr Val Lys Asp Val Asp Leu Lys Val Lys Lys Val 1.5 10 15
Leu Val Arg Val Asp Phe Asn Val Pro Leu Lys Asp Gly Val lie Thr 20 25 30
Asn Asp Asn Arg lie Thr Ala Ala Leu Pro Thr lie Lys Tyr lie lie 35 40 45
Glu Gin Gly G;y Arg Ala lie Leu Phe Ser His Leu Gly Arg Val Lys 50 55 60
Glu Glu Ala Asp Lys Glu Gly Lys Ser Leu Ala Pro Val Ala Ala Asp 65 70 75 80
Leu Ala Ala Lys Leu Gly Gin Asp Val Val Phe Pro Gly Val Thr Arg 85 90 35
Gly Ala Lys Leu Glu Glu Ala lie Asn Ala Leu Glu Asp Gly Gin Val
100
105 110
Leu Leu Val Glu Asn Thr Arg Phe Glu Asp Val Asp Gly Lys Lys Glu
115
120 125
Ser Lys Asn Asp Glu Glu Leu Gly Lys Tyr Trp Ala Ser Leu Gly Asp 130135 "0
Gly lie Phe Val Asn Asp Ala Phe Gly Thr Ala His Arg Ala His Ala 145 150 155 160
Ser Asn Val Gly lie Ser Ala Asn Val Glu Lys Ala Val Ala Gly Phe
165 170 175<formula>formula see original document page 18</formula><220>
<221> CDS
<222> (1) *(516)
<400> 5
atg aca cat att aca ttt gac tta Met Thr His lie Thr Phe Asp Leu
ttc aias Phe Lys 10
gtc ttg ggt Val Leu Gly
Gin
ttt Phe 15
gta Val
48
ggc gaa cac gag tta gac tac eta cca cca caa gta agt gca gca gat Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr L*eu Pro Pro Gin Val Ser Ala Ala Asp 20 25 30
96
get ttc ctt cgt caa ggg act ggt cct gga tea gat ttt etc gga tgg Ala Phe Leu Arg Gin Gly Thr ply Pro Gly Ser Asp Phe Leu Gly Trp 35 40 45
144
atg gaa cct cca gaa aac tat gac aaa gaa Met Glu Pro Pro Glu Asn Tyr Asp Lys Glu 50 55
gaa ttt tct cgc att caa Glu Phe Ser Arg lie Gin 右O
192
aaa gec get gaa aag att aaa tea gat age gaa gta etc gtg gtt att Lys Ala Ala Glii Lys工le Lys Ser Asp Se^r Glu Val Leu Val Val lie 65 "70 75 80
240
ggt att ggt ggt teg tac ctt ggt gca aaa Gly lie Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Ala liys 85 90
gca gca att gac Ala Ala lie Asp
ttt Phe 95
ttg lieu
288
aat aat cat ttt get aat ttg caa acc gca Asn Asn His Phe Ala Asn Leu Gin Thr Ala 100 105
gaa gaa cgt Glu <3lu Arg
33a 乙ys 110
Ala
cct Pro
336
cag att ctt t3t Gin lie Leu Tyr 115
get gga aat tct att tea tct act tac ctt gec gat Ala Gly Asn Ser lie Ser Ser Thr Tyr Leu Ala Asp 120 125
384
tta gtt gaa tac Leu Val Glu Tyr 130
gtc caa gat aaa gaa ttc tea gta aat gtc att tea Val Gin Asp Lys Glu Phe Ser Val Asn Val lie Ser 135 140
432
aaa tea ggt aca liys Ser Gly Thr 145
aca act gaa cca gcg att get ttc cgt gta ttt aaa Thr Thr G工u Pro Ala lie Ala Phe Arg Va工 Phe Lys 150 155 160
480
gaa ctt eta gtt aaa aag tac egg tea aga aga age Glu Leu l#eu Val Lys Lys Tyr Arg Ser Arg Arg Set
516
19165 170
<210> 6
<211> 172
<212> PRT
<213> B组链球菌
<400> 6
Met Thr His IJ^e Thr Phe Asp Leu Phe Lys Val Leu Gly Gin Phe Val
1 . . 5. 10 15 .
Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Gin Val Ser Ala Ala Asp 20 25 30
Ala Phe Leu Arg Gin Gly Thr Gly Pro Gly Ser Asp Phe I>eu Gly Trp 35 40 45
Met Glu Pro Pro Glu Asn Tyr Asp Lys Glu Glu虫he Ser Arg lie Gin 50 55 60
Lys Ala Ala Glu Lys lie Lys Ser Asp Ser Glu Val Leu Val Val lie 65 70 75 80
Gly lie Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Ala Lys Ala Ala lie Asp Phe Leu 85 90 95
Asn Asn His Phe Ala Asn Leu Gin Thr Ala Glu Glu Arg Lys Ala Pro 100 105 110
Gin lie Leu Tyr Ala Gly Asn Ser lie Ser Ser Thr Tyr Leu Ala Asp
115
120 125
Leu Val Glu Tyr Val Gin Asp Lys Glu Phe Ser Val Asn Val lie Ser
130
135 140
Lys Ser Gly Thr Thr Thr Glu Pro Ala lie Ala Phe Arg Val Phe Lys
145 150
155 160
Glu Leu Leu Val Lys Lys Tyr Arg Ser Arg Arg Ser
165
170
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> B组链球菌<220>
<221> CDS
<222> (1)(318)
<400> 7 att 3ac lie Asn
cga aga ttt aga tgg tct tgg tta tct tea aga aaa gat gta Arg Arg Phe Arg Trp Ser Trp Leu Ser Ser Arg Lys Asp Val 5 10 15
48
Asp
ttt Phe
gtt Val
sat 20
333
333
gca Ala
Thr
Asp 25
ggt gtg ctt ctt Gly Val Leu Leu
get cat Ala His 30
Thr
96
gat ggt ggg gtt cca aat atg ttt gta acg ctt cct aca caa gac get Asp Gly Gly Val Pro Asn Met Phe Val Thr Leu Pro Thr Gin Asp Ala 35 40 45
144
tac act ctt ggt tac act att tac ttc ttt gag tta gca att ggc ctt Tyr Thr Leu Gly Tyr Thr lie Tyr Phe Phe Glu Leu Ala lie Gly Leu 50 55 60
192
tea ggt tat ctt aac tea gta aat cca ttt gat caa ccg ggg gta gaa Ser Gly Tyr Leu Asn Ser Val Asn Pro Phe Asp Gin Pro Gly Val Glu 65 70 75 80
240
gca tat aaa cgt aat atg ttc gca ttt ggt aaa cct gga ttc gaa gag Ala Tyr Lys Arg Asn Met Phe Ala Phe Gly Lys Pro Gly Phe Glu Glu 85 90 95
288
ctt lieu
age get gaa Ser Ala Glu 100
ttg aat gca cgt Leu Asn Ala Arg
ctt Leu 105
318
<210> 8
<211> 105
<212> PRT
<213> B组链球菌
<400> 8
lie Asn Arg Arg Phe Arg Trp Ser Trp Leu Ser Ser Arg Lys Asp Val 15 10 15
Asp Phe Val Asn Lys Lys Ala Thr Asp Gly Val Leu Leu Ala His Thr 20 25 30
Asp Gly Gly Val Pro Asn Met Phe Val Thr Leu Pro Thr Gin Asp Ala35 40 45
Tyr Thr Leu Gly Tyr Thr lie Tyr Phe Phe Glu Leu Ala lie Gly Leu 50 55 60
Ser Gly Tyr Leu Asn Ser Val Asn Pro Phe Asp Gin Pro Gly Val Glu 65 70 75 80
Ala Tyr Lys Arg Asn Met Phe Ala Phe Gly Lys Pro Gly Phe Glu Glu
85 90 95
Leu Ser Ala Glu Leu Asn Ala Arg Leu 100 105
<210> <211> <212> <213>
<220> <221> <222>
9
804 DNA
B组链球菌
CDS
(1) -(804)
atg aca Met Thr
tta tta gaa aaa att aat gag act aga gac ttt ttg Leu Leu Glu Lys lie Asn Glu Thr Arg Asp Phe Leu 5 10
333 ggc Lys Gly
ggs gaa Gly Glu
gac ate Asp lie 50
ttt agt Phe Ser 65
gtc Val
ttg l*eu 35
ccm Xaa
gta Val
aca gca cca gaa ttt ggy ctt att tta ggc tct Thxr Ala Pro Glu Phe Xaa I*eu lie Leu Gly Ser 20 25 30
get gaa gaa ate gaa aat cc(t att gtt gtg gat Ala Glu Glu lie Glu Asn Pro lie Val Val Asp 40 45
aat tgg gga cag tea aca gta gtt ggt cat get Asn Trp Gly Gin Ser Thxr Val Val Gly His Ala 55 60
tgg gat tta tea ggc cgt aag gta tta gcg ctt Trp Asp Leu Ser Gly Arg Lys Val Leu Ala Leu 70 75
C33
Gin 15
Gly
Tyr
gga Gly
C33
Gin
gca 48 Ala
tta 96 Leu
gca 144 Ala
333 192 Lys
ggt 240 Gly 80
cgt ttt cat ttt tay gaa ggw aat aca atg gaa gtc gtt act ttc cca 288 Arg Phe His Phe Tyr Glu Xaa Asn Thr Met Glu Val Val Thr Phe Pro85
90
95
gta cgt ate Val Arg lie
这tg sga gca ttg get Met Arg Ala Leu Ala 100
tgc cac agt gtg ctt gtg act aat Cys His Ser Val Leu Val Thr Asn 105 110
336
gca gcg ggt Ala Ala Gly 115
ggg att gga tac gga Gly lie Gly Tyr Gly 120
cca gga act tta atg ctg ate aaa Pro Gly Thr Leu Met Leu lie Lys 125
384
gac cac ate Asp His lie 130
aat atg att ggg act aac cct etc ata ggt gag aac ctt Asn Met工le Gly Thr Asn Pro Leu lie Gly Glu Asn Leu 135 140
432
gaa gaa ttt Glu Glu Phe 145
gga cca cgt ttc cesi Gly Pro Arg Phe Pro 150
gac atg teg get tay aca gca
Asp Met Ser Asp Ala Tyr Thr Ala 155 160
480
aca tat cga Thr Tyr Arg
C33 333
Oln Lys 165
get cac ess Ala His Gin
att get gaa aac gat ate aaa etc lie Ala Glu Asn Asp lie I*ys Leu 170 175
528
gaa gaa ggt gtg tac Glu Glu Gly Val Tyr 180
ttg ggt gt3 Leu Gly Val
tea gga ccc act tat gaa aca cct Ser Gly Pro Thr Tyr Glu Thr Pro 185 190
576
gca gaa 3tt cgt gca Ala Glu lie Arg Ala 195
ttC 3C3
Phe Gin Thr 200
stg ggc gca caa gcg gta ggt atg Met Gly Ala Gin Ala Val Gly Met 205
62 4
tec aqg gtt cca gag gtg ate gtt Ser Thr VaJL Pro Glu Val lie Val 210 215
gca get cac tea ggg ctt 3aa gtg Ala Ala His Ser Gly Leu Lys Val 220
672
tta gga att tea gca att act aac Leu Gly lie Ser Ala lie Thr Asn 225 230
ctt gec get ggc ttc caa tea gag Leu Ala Ala Gly Phe Gin Ser Glu 235 240
720
etc aat C3t gag gag gtc gtt gaa gtt act cag cgt att aaa gaa gat Leu Asn His Glu Glu Val Val Glu Val Thr Gin Arg lie Lys Glu Asp 245 250 255
768
ttc aag gga tta ggt aaa tea tta gtt get gaa etc Phe Lys Gly Leu Gly Lys Ser Leu Val Ala Glu Leu 260 265
804
<210> 10
23<211> 268 <212> PRT <213> B组链球菌
<400> 10
Met Thr Leu Leu Glu Lys lie Asn Glu Thr Arg Asp Phe Leu Gin Ala 1.5 10 15
Lys Gly Val Thr Ala Pro Glu Phe Xaa Leu lie Leu Gly .Ser Gly Leu 20 25 30
Gly Glu Leu Ala Glu Glu lie Glu Asn Pro lie Val Val Asp Tyr Ala 35 40 ' 45
Asp lie Xaa Asn Trp Gly Gin Ser Thr Val Val Gly His Ala Gly Lys 50 55 60
Phe Ser Val Trp Asp 一eu Ser Gly Arg Lys Val Leu Ala Leu Gin Gly 65 70 75 80
Arg Phe His Phe Tyr Glu Xaa Asn Thr Met Glu Val Val Thr Phe Pro 85 90 95
Val Arg lie Met Arg Ala Leu Ala Cys His Ser Val Leu Val Thr Asn 100 105 110
Ala Ala Gly Gly lie Gly Tyr Gly Pro Gly Thr Leu Met Leu lie Lys 115 120 125
Asp His 工le Asn Met lie Gly Thr Asn Pro Leu lie Gly Glu Asn Leu-130 135 140
.Glu Glu Phe GJLy Pro Arg Phe Pro Asp Met Ser Asp Ala Tyr TJir Ala 145 150 155 160
Thr Tyr Arg Gin Lys Ala His Gin lie Ala Glu Asn Asp lie Lys Leu 165 1"70 175
Glu Glu Gly Val Tyr Leu Gly Val Ser Gly Pro Thr Tyr Glu Thr Pro 180 185 190
Ala Glu lie Arg Ala Phe Gin Thr Met Gly Ala Gin Ala Val Gly Met 135 200 205
Ser Thr Val Pro Glu Val lie Val Ala Ala His Ser Gly Leu Lys Val 210 215 220
Leu Gly lie Ser Ala lie Thr Asn Leu Ala Ala Gly Phe Gin Ser Glu
24225
230
235
240
Leu Asn His Glu Glu Val Val Glu Val Thr Gin Arg lie Lys Glu Asp 245 250 255
Phe Lys Gly Leu Gly Lys Ser Leu Val Ala Glu Leu 260 265
<210> 11
<211> 1428
<212> DNA
<213> B组链球菌
<220> <221> <222〉
CDS (1),
《1428)
ttg Leu
11 Thr Lys
gaa Glu
tat caa aat tat gtc Tyr Gin Asn Tyr Val
aat ggc Asn Gly 10
gaa tgg Glu Trp
333
Lys
tea Ser 15
tct Ser
48
gtt Val
33t
Gin
3tt
lie 20
gag att ttg tea Glu lie Leu Ser
CC3
Pro 25
3tt gat 工le Asp
gat tct Asp Ser
tC3
Ser 30
ttg Leu
Gly
96
tte gtg cca gcg atg act cga gaa gaa gtt gat cat get atg aaa gcg Phe Val Pro Ala Met Thr Arg Glu Glu Val Asp His Ala Met Lys Ala 35 40 45
144
ggt cgt gag get tta cca get tgg get get tta aca gta tat gaa cgt Gly Arg Glu Ala Leu Pro Ala Trp Ala Ala Leu Thr Val Tyr Glu Arg 50 55 60
192
gca caa tac ctt cat aaa gec gca gac att att gaa cgt gat aaa gaa Ala Gin Tyr Leu His Lys Ala Ala Asp lie lie Glu Arg Asp Lys Glu 65 70 75 80
240
gaa att get act gtt tta gca aaa gaa att tct aaa get tac aat get Glu lie Ala Thr Val Leu Ala Lys Glu lie Ser Lys Ala Tyr Asn Ala 85 30 95
288
tea gta set Ser Val Thr
gag gtt gta agg aca get gat ctt att cgt tat gca gca Glu Val Val Arg Thr Ala Asp Leu lie Arg Tyr Ala Ala 100 105 110
336gaa gaa gga att cgt tta tea act tea get gac gaa ggt gga aaa atg G1U Glu Gly lie Arg Leu Ser Thr Ser Ala Asp Glu Gly Gly Lys Met 115 120 125
384
gat get tea aca ggt cat aag ttg get gtt att cgt cgt caa cca gta Asp Ala Ser Thr Gly His Lys Leu Ala Val工le Arg Arg Gin Pro Val 130 135 140
432
ggt ate gtt tta gca ate gca cct tat aat tac cct gtt aac etc tea Gly lie Val Leu Ala lie Ala Pro Tyr Asn Tyr Pro Val Asn Leu Ser 145 150 155 160
480
gga tea Gly Ser
333
att gcg 工le Ala 165
cca get eta att Pro Ala Ijeu lie
ggt
Gly 170
Gly
d3C
Asn
gtt Val
gtg
Val
atg Met 175
ttt Phe
528
aaa cca cca aca caa ggt tea gtc tea gga ctt gtt tta gca aaa get Iiys Pro Pro Thr Gin Gly Ser Val Ser Gly Leu Val I*eu Ala Lys Ala 180 185 190
576
ttt gca gaa gca ggt ctt cca gca ggt gtc ttt aat act att aca gga Phe Ala Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Phe Asn Thr lie Thr Gly 195 200 205
624
cgc ggt tct gag att gga gat tac att gtt gag cat gaa gaa gtt aat Arg Gly Ser Glu lie Gly Asp Tyr lie Val Glu His Glu Glu Val Asn 210 215 220
6*72
ttt att sac ttt aca gga tea acg cca gtt gga caa cgt att ggt aag Phe lie Asn Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Gin Arg lie Gly Lys 225 230 235 240
720
ttg gca
gga Gly
atg cgt Met Arg 245
cca att atg ctt Pro lie Met Leu
gag Glu 250
ttg Leu
ggc Gly
ggt
Gly
aag Lys
gat
Asp 255
gca Ala
768
ggt ate gtc tta get gat get gac ctt gat aac get get aaa caa ate Gly lie Val Leu Ala Asp Ala Asp Leu Asp Asn Ala Ala Lys Gin lie 260 265 270
816
gtt gca ggt get tat gat tac tct gga caa cgc tgt acg gca att aag Val Ala Gly Ala Tyr Asp Tyr Ser Gly Gin Arg Cys Thr Ala lie Lys 275 280 285
864
cgt gtg ctt gtc gtt gaa gaa gtt gew gat gaa ttg gca gaa aaa ata Arg Val Leu Val Val Glu Glu Val Xaa Asp Glu Leu Ala Glu Lys lie 230 295 300
912tct gaa aat gta gca aaa tta tea gta ggt gat cca ttt gat aat gca 960 Ser Glu Asn Val Ala Lys Leu Ser Val Gly Asp Pro Phe Asp Asn Ala 305 310 315 320
ac^ gtg aca Thr Val Thx:
ccg gtt att gat gat aat tea get gac ttt att gaa age Pro Val lie Asp Asp Asn Ser Ala Asp Phe lie Glu Ser 325 330 335
1008
tta gta gta gat gca cgt Leu Val Val Asp Ala Arg 340
aaa cgt gat ggt cgt eta Lys Arg Asp Gly Arg Leu 355
tta gat atg aaa eta get Leu Asp Met Lys lieu Ala 370
caa aaa ggt gcg aaa gaa G丄n Lys Gly Ala Iiys Glu 345
tta act cca gga ttg ttt Leu Thr Pro Gly Leu Phe 360
tgg gaa gag cet ttt gga Trp Glu Glu Pi:o Phe Gly 375 380
ttg aat gaa ttt 1056 Leu Asn Glu Phe 350
gat cat gtt act 1104 Asp His Val Thr
cca att etc cca 1152 Pro lie Leu Pro
att att cgt gtc aag gat gca gaa gaa lie lie Arg Val Lys Asp Ala Glu Glu 385 390
tct gat ttt gga tta caa tea tea gtc Ser Asp Phe Gly Leu Gin Ser Ser Val 405
gca ttt gat ata gca aat aaa ctt gaa Ala Phe Asp lie Ala Asn Lys Leu Glu 420 425
get gtt get att gec aac aaa 1200 Ala Val Ala lie Ala Asn Lys 395 400
ttt aca cgt gat ttc caa aaa 1248 Phe Thr Arg Asp Phe Gin Lys "0 415
gtt ggt aca gtt cac att.aac 1296 Val Gly Thr Val His lie Asn 430
aat aag act gga cgt ggt ccw gat aat ttc cca ttc tta Asn Lys Thr Gly Arg Gly Xaa Asp Asn Phe Pro Phe Leu 435 440 445
gga etc aaa Gly Leu Lys
1344
gga tct ggt gca ggt gtt caa ggt ate aga GJLy Ser Gly Ala Gly Val Gin Gly lie Arg 450 455
tat tea att Tyr Ser lie 460
gaa gca atg Glu Ala Met
1392
aca aat gta aaa tcg att gtt etc gat atg aaa tag 1428 Thj: Asn Val Lys Ser lie Val Leu Asp Met Lys 465 470 475
<210> 12 <211> 475 <212> PRT<213> B组链球菌
<400> 12
Leu Thr Lys Glu Tyr Gin Asn Tyr Val Asn Giy Glu Trp Lys Ser Ser 1 5 10 . 15
Val Asn Gin lie Glu lie Leu Set Pro lie Asp Asp Ser Ser Leu Gly 20 25 30
Phe Val Pro Ala Met Thr Arg Glu Glu Val Asp His Ala Met .Lys Ala 35 40 45
Gly Arg Glu Ala Leu Pro Ala Trp Ala Ala Leu Thr Val Tyr Glu Arg 50 55 60
Ala Gin Tyr Leu His Lys Ala Ala Asp lie lie Glu Arg Asp Lys Glu 65 70 75 80
Glu lie Ala Thr Val Leu Ala Lys Glu lie Ser Lys Ala Tyr Asn Ala 85 90 95
Ser Val Thr Glu Val Val Arg Thr Ala Asp Leu工le Arg Tyr Ala Ala 100 105 110
Glu Glu Gly lie Arg Leu Ser Thr Ser Ala Asp Glu Gly Gly Lys Met 115 120 125
Asp Ala Ser Thr Gly His. Lys Leu Ala Val lie Arg Arg Gin Pro Val 130 135 140
Gly lie Val Leu Ala lie Ala Pro Tyr Asn Tyr Pro Val Asn Leu Ser 145 150 155 160
Gly Ser Lys lie Ala Pro Ala Leu lie Gly Gly Asn Val Val Met Phe 165 170 175
Lys Pro Pro Thr Gin Gly Ser Val Ser Gly Leu Val Leu Ala Lys Ala 180 185 190
Phe Ala Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Phe Asn Thr lie Thr Gly 195 200 205
Arg Gly Ser Glu lie Gly Asp Tyr lie Val Glu His Glu Glu Val Asn 210 215 220
Phe lie Asn Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Gin Arg lie Gly Lys 225 230 235 240
28<formula>formula see original document page 29</formula>
权利要求
1. 一种由任一已被鉴定为MS4、MS11、MS14和MS16的可获自B组链球菌的基因所编码的肽，或与其具有至少60％序列相似性的同源物，或其保持了引发免疫应答的能力的功能性片段。
2. 权利要求l的肽，其中所述同源物与由鉴定为MS4、 MSll、 MS14 或MS16的可获自B组链球菌的基因所编码的肽具有至少80%的序列相似 性。
3. 根据权利要求1的肽，其任一M酸序列为已确定的SEQ ID N0S, 2, 4， 6， 8和10。
4. 根据权利要求l-3任一项的肽，其用于医疗用途。
5. 编码权利要求1-3任一项的肽的多核苷酸，其用于医疗用途。
6. —种被转化以表达权利要求1-3任一项的肽的宿主。
7. 包含权利要求1-3任一项的肽的疫苗，或用于其表达的工具。
8. 权利要求1-6中任一权利要求的产物的用途，用于与细菌感染 相关的疾病治疗或预防的药物的制造。
9. 根据权利要求8的用途，其中的感染是B组链球菌感染。
10. 根据权利要求8或9的用途，其中的感染是病灶性感染。
11. 根据权利要求8或9的用途，其中的感染是尿道感染。
12. —种抗权利要求l-3任一项的肽的抗体。
全文摘要
本发明涉及外表面蛋白质及其基因和用途。根据本发明，在B组链球菌中鉴定了一系列基因，其产物可能位于生物体的外表面上。该基因或其功能性片段可用于治疗物质，例如使患者免受微生物感染的疫苗的制备。
文档编号C12N9/22GK101486756SQ20081017618
公开日2009年7月22日 申请日期1999年12月22日 优先权日1998年12月22日
发明者C·J·亨伍德, G·杜根, J·C·穆尔, J·D·桑坦格罗, J·D·莱恩, M·J·G·休斯, P·埃弗里斯特, R·J·多布森, R·K·威尔逊, R·菲尔德曼 申请人:微科学有限公司