一种互花米草耐盐蛋白hkt及其编码基因和应用
【技术领域】
[00011本发明涉及一种互花米草耐盐蛋白HKT，具体涉及一种互花米草耐盐蛋白HKT及其 编码基因和应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]自然界诸多环境因子如盐渍、重金属、干旱等都会限制或影响植物的正常生长发 育，其中盐渍是影响最普遍的胁迫因子。盐渍胁迫可造成植物细胞脱水，膜系统损伤，膜上 酶活性紊乱，各种代谢活动无序进行;还会使光合速率下降，呼吸速率发生变化，诱导糖类 和蛋白质转变成可溶性化合物等。
[0003] 互花米草(Spartina alternif lora Loisel，）为禾本科米草属多年生草本植物， 原产于北美大西洋沿岸，生长于海岸滩涂，可耐受周期性潮汐引起的全海水(约含3%NaCl) 的淹没，是高度耐盐的泌盐盐生植物。互花米草的抗胁迫能力和繁殖能力较强，生长迅速， 1979年从美国引入我国南方地区，在保滩护岸、加速淤积、控制污染等方面取得了一定的生 态和经济效益。从互花米草中发掘、定位、克隆耐盐相关基因，将对探究植物耐盐机制具有 重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种互花米草耐盐重要蛋白HKT及其编码基因和应用，该 蛋白及其编码基因可以提尚植物的耐盐性。
[0005 ]为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0006] 一种互花米草耐盐蛋白HKT，来源于互花米草（Spart ina al tern i f lora Loisel，），是如下(a)或(b):
[0007] (a)序列如SEQ ID N0，1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (b)将SEQ ID N0，1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列SEQ ID N0，1衍生的蛋白质。
[0009] 上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0010] 本发明所述的蛋白HKT的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0011] 所述的编码基因为（1)至(4)中任一所述的DNA分子：
[0012] 1)序列如SEQ ID N0,2所示的DNA分子；
[0013] 2)如SEQ ID N0,2所示序列中自5'末端第80至1756位核苷酸所示的DNA分子；
[00M] 3)在严格条件下与⑴或（2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐相关蛋白的DNA 分子；
[0015] 4)与（1)或⑵或（3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码植物耐盐相关蛋 白的DNA分子。
[0016] 所述的严格条件为在0，1XSSPE或0，1XSSC和0，1%SDS的溶液中，65°C条件下杂 交并洗膜。
[0017] 本发明还要求保护含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组 菌。
[0018] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等;所述植物表达载体还可包含外源基 因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片 段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。
[0019] 使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外，使 用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅 读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0020] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性 的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0021 ]所述重组表达载体具体为将所述基因插入植物表达载体Superl300的多克隆位点 得到的重组质粒。
[0022] 本发明还提供了所述编码基因或含有该基因的重组载体在培育耐盐转基因植物 中的应用，具体为通过将所述的基因或重组载体导入目的植物中，得到耐盐性高于所述目 的植物的转基因植物。
[0023] 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0024] 同时，扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 [0025]本发明所达到的有益效果是:一种互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因和应用，将 对植物耐盐分子机制的研究，植物耐盐品种的选育及植物耐旱性分子育种具有重要的理论 及实际意义，为提高植物的耐盐性提供了一条经济、快速、有效的途径，本发明在农业领域 将具有广阔的应用和市场前景。
【附图说明】
[0026]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的 附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领 域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附 图。
[0027] 图1为本发明中第一次RACE后的琼脂糖凝胶电泳图，其中M:Marker2000; 1 :SaHKT 3'-RACE产物；2:SaHKT5'-RACE产物。
[0028] 图2为本发明中第二次RACE后的琼脂糖凝胶电泳图，其中M:Marker2000; 1 :SaHKT 3'-RACE产物；2:SaHKT5'-RACE产物。
[0029] 图3为本发明中盐胁迫处理下互花米草HKT8基因的表达差异。
【具体实施方式】
[0030] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]实施例1:互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因的克隆与鉴定互花米草：公众可以 从山东莱州海滨获得;参考文献:韩会玲，张侠，尹海波，陈世华，郭善利，盐胁迫和镉胁迫下 互花米草生理特性的变化，江苏农业科学，2013，41 (2): 361-363。
[0034]以互花米草为材料提取总RNA，反转录获得cDNA，以该DNA为模板，以3'-RACE引物、 5 ' -RACE引物进行PCR扩增。
[0035] 一、Bizol试剂法提取互花米草的总RNA
[0036] (1)称取不同处理的新鲜互花米草叶片约0.2g，在液氮中研磨成粉末状，将粉末转 移到1 · 5ml的Eppendorf管中。
[0037] (2)预先在1 · 5ml的Eppendorf管中加入lml的trizol，用力震荡15min。
[0038] (3)室温下静置5min。
[0039] (4)4Γ，10000γρπι 离心 lOmin。
[0040] (5)取上清，加200μ1氯仿，混匀，室温下静置2~5min。
[0041] (6)4°C，lOOOOrpm离心10min。
[0042] (7)取上清加入另一 1 · 5ml的Eppendorf管中，加入500μ1预冷的异丙醇，-20°C沉淀 20min〇
[0043] (8)4°C，12000rpm离心 15min。
[0044] (9)弃上清，加 lml75 %的乙醇，清洗沉淀。
[0045] (10)倒掉乙醇，4°C，12000rpm，离心lmin。
[0046] (11)在超净工作台内用灭过菌的枪头将剩余液体吸干，同时在超净工作台内风吹 5~10min〇
[0047] (12)用不含RNase的DEPC水溶解RNA(