SARS－CoV病毒结构蛋白的融合蛋白及其高量表达与纯化和用途的制作方法

专利名称：SARS－CoV病毒结构蛋白的融合蛋白及其高量表达与纯化和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白及其在哺乳动物细胞中的高量表达；用所述融合蛋白在制备防治SARS-CoV病毒感染的基因工程疫苗和药物的用途；以及用所述融合蛋白在制备检测SARS-CoV病毒感染试剂盒的用途。本发明还涉及SARS-CoV病毒结构蛋白S的有毒片段的发现；以及设计预防SARS-CoV病毒感染的各类疫苗。
背景技术：
严重急性呼吸系统综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的病原体是一种新型冠状病毒(SARS-CoV)，其宿主范围广，传播速度快，且可通过飞沫甚至空气传播，危害极大。因此，SARS-CoV病毒感染的预防、治疗及检测的研究迫在眉睫。
由于SARS-CoV病毒疫苗的应用对象是人，疫苗的稳定和安全可靠是最基本、最重要的要求。而基因工程疫苗的研究已较为成熟，与此要求最为相符。
SARS-CoV病毒存在S、M、N和E四种结构蛋白。实验生物信息学的研究表明S蛋白和N蛋白具有强烈的免疫原性，是疫苗研究的主要抗原。M和E也存在一定的免疫原性，都有可能成为有效疫苗。其中S蛋白成为有效疫苗的可能性最大。
但由于S蛋白本身的特点，使其在成功表达全长的有活性的S蛋白及S蛋白的纯化方面存在重重困难。
由于S蛋白存在大量的翻译后修饰位点，主要是糖基化位点，致使通过原核细胞表达或酵母表达的蛋白将不能正确地折叠，影响其生物活性。只有在哺乳动物细胞中表达，S蛋白才能进行正确地修饰，折叠和加工处理，也更接近自然状态，否则将会严重影响疫苗的免疫效果。但是，S病毒原编码的S蛋白在哺乳动物细胞表达系统中表达量很低，难以在实际中应用。
因此，为制备有效的SARS-CoV病毒疫苗，必须解决三个问题一是使SARS-CoV病毒S蛋白在哺乳动物细胞中有效表达，并在纯化过程中尽可能选择合适的条件，使所表达的蛋白能够与宿主蛋白和DNA有效分离，以保证病毒蛋白的结构尤其立体结构不被破坏；二是提高S蛋白的表达产量，使疫苗的生产更为经济。三是疫苗的安全性，SARS-CoV病毒致病机理的研究有限，SARS-CoV病毒是如何导致急性肺损伤，心脏功能衰竭，以及免疫系统崩溃的途径并不清楚，现有技术SARS疫苗的制备中存在安全隐患。而且现有技术未能解决这个问题，因此，制备安全有效的SARS-CoV病毒疫苗需要进一步的发明研究。

发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种能够在哺乳动物细胞株中表达的SARS-CoV病毒S蛋白基因片段。
本发明的第二个目的是将SARS病毒的结构蛋白及其截短形式的融合蛋白在哺乳动物细胞表达系统中进行高量表达和纯化。
本发明的第三个目的是用所得到的SARS病毒的结构蛋白的融合蛋白，包括S蛋白的融合蛋白，制备预防SARS-CoV病毒感染的基因工程疫苗；我们的研究发现，S蛋白与其受体ACE2的结合可导致或加剧机体的急性呼吸窘迫综合症，研发安全有效的疫苗需要删除或修饰S蛋白中与其受体ACE2结合的片段。
本发明的第四个目的是用所得到的SARS-CoV病毒的结构蛋白的融合蛋白，制备检测SARS-CoV病毒感染的试剂盒。
本发明的第五个目的是用所得到的S蛋白融合蛋白制备和筛选治疗SARS-CoV病毒感染的药物。
本发明的第六个目的是用SARS-CoV病毒S蛋白的已去除，突变，或修饰其氨基酸318-510片段并使S蛋白不能与其受体ACE2结合的片段制备预防SARS-CoV病毒感染的疫苗，包DNA疫苗，蛋白疫苗，和病毒载体疫苗等。
在本文中，S蛋白截短形式的描述以如下方式表示“Sa-b”表示从野生型SARS-CoV病毒的全长的S蛋白的第a位氨基酸到第b位氨基酸。
当a是起始第一个氨基酸时，以“Sb”方式表示。
例如，S318-510是指该基因片段表达出的蛋白是整个SARS-CoV病毒S蛋白的318到510位氨基酸，S511是指该基因片段表达出的蛋白是整个SARS-CoV病毒S蛋白的1到511位氨基酸，S685是指该基因片段表达出的蛋白是整个SARS-CoV病毒S蛋白的1到685位氨基酸，依此类推。
本发明的技术解决方案包括一种SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白，其结构为X-Y-Z，其中X包括SARS-CoV病毒结构蛋白S或M或E或N，或以上结构蛋白的任意截短形式，所述SARS-CoV病毒结构蛋白S包括去除、修饰或者突变第318位氨基酸到510位氨基酸任意氨基酸片段，或者去除、修饰或突变第318位氨基酸到510位氨基酸片段；Y是连接部分，由0-20个任何氨基酸组成；Z是包含铰链区、CH2、CH3结构域的人IgG1的Fc及其变体或蛋白标签。
所述蛋白标签包括且不限于六组氨酸(6XHis)标签、聚乙二醇(PEG)标签和人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)标签。
所述SARS-CoV病毒结构蛋白S包括蛋白S的全长或其任意截短形式。
所述SARS-CoV病毒结构蛋白S是不能与受体ACE2结合或者降低与ACE2结合能力的蛋白。
所述的Y优选是两个氨基酸，所述的氨基酸为赖氨酸和精氨酸。
本发明还涉及一种能够在哺乳动物细胞株中表达的SARS-CoV病毒S蛋白基因，其特征在于所述的基因为SEQ ID NO1。
本发明进一步涉及一种含有SEQ ID NO1的重组表达质粒，所述的质粒包括真核PEAK系列。
本发明还进一步涉及哺乳动物细胞株，其含有所述的能够表达SARS-CoV病毒S蛋白基因的所述的SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白。该哺乳动物细胞株，包括CHO、293和Vero细胞株及其衍生细胞株。
本发明还涉及所述的SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白的制备方法，包括(1)转染能够表达权利要求1所述融合蛋白及内源性二氢叶酸还原酶(endogenous dihydrofolate reductase)(dhfr)的重组表达质粒，构建哺乳动物细胞表达株；(2)该哺乳动物细胞表达株在正常生长状态下每24小时每百万细胞在其培养基中产生10μg以上重组蛋白；(3)纯化通过步骤(2)表达的蛋白。
在该方法中，所述的重组表达质粒含有的融合蛋白的引导序列，该序列是CD5蛋白的引导序列。所述的重组表达质粒，其结构蛋白的编码基因进行人工合成，用人体细胞内常用或者偏好密码子替换相同氨基酸的病毒基因中的密码子序列，对病毒的结构蛋白进行人类密码子优化。所述的表达SARS-CoV病毒的结构蛋白的融合蛋白，其用人体细胞常用或者偏好密码子合成的SARS-CoV的S蛋白基因如SEQ ID NO1所示。
构建哺乳动物细胞表达株所用的筛选药物优选包括嘌呤霉素和氨甲蝶呤。
在该方法步骤(2)是每24小时每百万细胞在其培养基中可产生30μg或者以上的重组蛋白。
本发明还涉及所述的融合蛋白在制备预防SARS-CoV病毒的疫苗中的用途；以及在制备SARS-CoV病毒检测试剂盒中的用途；在制备或筛选抗SARS-CoV病毒感染的药物中的用途；在制备防止SARS-CoV病毒感染的抗体中的用途。
本发明还特别涉及一种去除、修饰或者突变表达SARS-CoV病毒结构蛋白S第318位氨基酸到510位氨基酸任意氨基酸片段，或者去除、修饰或突变表达SARS-CoV病毒结构蛋白S第318位氨基酸到510位氨基酸片段序列的DNA序列以及由这种DNADNA表达的氨基酸。
本发明进一步涉及所述的DNA序列或者所述的DNA表达的氨基酸在制备预防SARS-CoV病毒的疫苗中的用途，所述的疫苗包括DNA载体疫苗，蛋白疫苗，病毒载体疫苗。


图1是用Western Blotting的方法确定优化后的E、M、N和S的融和蛋白宿主细胞中表达的检测结果。从左到右分别为E-Fc、M-Fc、N-Fc和S-Fc。结果证明SARS-CoV病毒的四种结构蛋白均可在宿主细胞中得到较好的表达。
图2是S1190基因片段插入表达载体后酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果。从左向右三个泳道依次为λ-Hind III Marker，S1190，DL2000Marker。λ-Hind IIIMarker从小到大(从底端到上端)依次为564bp(从图中较难分辨)、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp、23130bp；DL2000Marker从小到大(从底端到上端)依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp，证明S1190的基因片段已经插入到表达载体中。
图3是用Western Blotting的方法确定融合蛋白S1190-Fc在宿主细胞中表达的检测结果，证明融合蛋白S1190-Fc可以在宿主细胞中得到较好的表达，表达出的蛋白大小约为185KD。
图4是纯化后的融合蛋白S1190-Fc聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色的结果，证明可以得到较为纯净的融合蛋白S1190-Fc。
图5是融合蛋白S1190-Fc在4℃结合Vero E6细胞的细胞流式结果。由结果可知，融合蛋白S1190-Fc与Vero E6细胞结合。通过国际上已发表的文献可知，VeroE6细胞表面存在S蛋白的受体ACE2，ACE2的结合S蛋白的区域为318位到510位氨基酸。所以，用此细胞粘附融合蛋白S1190-Fc，可检测表达出的融合蛋白S1190-Fc的活性。图中空白的峰形区域是阴性对照(PBS缓冲液)，阴影部分是实验结果，证明融合蛋白S1190-Fc粘附Vero E6细胞。
图6是融合蛋白S1190-Fc与转染了人源ACE2(hACE2)的293E细胞结合的细胞流式结果。转染了hACE2的293E细胞与融合蛋白S1190-Fc在4℃进行结合后，再与FITC标记的抗Fc的抗体结合，未转染的293E细胞结合Fc抗体作为阴性对照(空白峰形区域)，然后用流式进行检测。结果证明转染了hACE2的293E细胞与融合蛋白S1190-Fc结合，发生明显位移(阴影部分)。
图7是融合蛋白S1190-Fc与转染了鼠源ACE2(mACE2)的293E细胞结合的细胞流式结果。转染了mACE2的293E细胞与融合蛋白S1190-Fc在4℃进行结合后，再与FITC标记的抗Fc的抗体结合，未转染的293E细胞结合Fc抗体作为阴性对照(空白峰形区域)，然后用流式进行检测。结果证明转染了mACE2的293E细胞与融合蛋白S1190-Fc结合，发生明显位移(阴影部分)。
图8的左图是293ET细胞分别转染了ACE2及S1190基因后发生了细胞融合的照片(放大100倍)；右图是293ET细胞分别转染了CD4及S1190基因后未发生细胞融合的照片(放大100倍)。证明蛋白S1190与ACE2结合，并能够导致细胞融合。
图9是S1190-Fc与ACE2受体的免疫共沉淀(IP)的结果。将分别转染了S1190-Fc和ACE2，对照Fc和ACE2的细胞裂解，然后用Western Blotting的方法进行检测。左侧的第一条条带是转染了对照Fc和ACE2的细胞裂解液作为对照，第二条条带是转染了对照Fc和ACE2的细胞裂解液IP结果，第三条条带是转染了S1190-Fc和ACE2的细胞裂解液作为对照，第四条条带是转染了S1190-Fc和ACE2的IP结果。结果证明了蛋白S1190与ACE2受体结合，Fc对S1190与受体ACE2的结合没有影响。
图10是用培养细胞做ACE2受体下调实验的结果。将Vero E6细胞分别在4℃(篮线)和37℃(红线)与融合蛋白S1190-Fc充分作用，同时用Fc作为对照(黑线)，然后用抗Fc的抗体进行检测。结果证明在37℃时，融合蛋白S1190-Fc与受体ACE2相互作用，并导致ACE2受体下调。
图11是用培养细胞做ACE2受体下调实验的结果。将Vero E6细胞分别在4℃(篮线)和37℃(红线)与融合蛋白S1190-Fc充分作用，同时用Fc作为对照(黑线)，然后用抗ACE2的抗体进行检测。结果证明在37℃时，融合蛋白S1190-Fc与受体ACE2相互作用，并导致ACE2受体下调。
图12是野生型小鼠肺部酸或盐灌注并加注融合蛋白S1190-Fc的肺弹回率变化的结果。将小鼠分为4组，每组5到7只，两组进行酸灌注，并加注融合蛋白S1190-Fc和对照Fc，两组进行盐灌注，同样加注融合蛋白S1190-Fc和对照Fc，每只小鼠灌注剂量为5.5nmol/kg融合蛋白S1190-Fc或5.5nmol/kg对照Fc。结果证明野生型小鼠酸灌注加注融合蛋白S1190-Fc组与酸灌注加注对照Fc组相比，在全部的测量时间内弹回率的变化具有显著性差异(p＜0.05)，酸灌注加注融合蛋白S1190-Fc组肺弹回率变化幅度明显高于酸灌注加注对照Fc组。证明在酸灌注条件下，融合蛋白S1190-Fc加重急性肺损伤。
图13是小鼠肺组织病理切片。将图1
中同样处理的小鼠肺组织制成病理切片，结果与图1
中所述结果吻合。在酸灌注条件下，肺组织出现明显水肿，发生急性肺损伤，与对照Fc相比，加入了融合蛋白S1190-Fc后明显加剧了急性肺损伤的程度。
图14是肺损伤评分结果。此结果印证了图11和图12的结果，证明在酸灌注条件下，肺组织发生急性肺损伤，与对照Fc相比，加入了融合蛋白S1190-Fc后明显加剧了急性肺损伤的程度，两者具有显著性差异(p＜0.01)。
图15是湿干肺组织重量比的结果。此结果印证了图11、12、13的结果。证明在酸诱导的急性肺损伤的情况下，相较于对照Fc组，加入融合蛋白S1190-Fc组所造成的肺水肿程度更为严重，湿干肺组织重量比更大，与对照Fc组相比具有显著性差异(p＜0.05)。
图16野生型小鼠肺部酸或盐灌注并加注融合蛋白S1190-Fc或融合蛋白S318-510-Fc的肺弹回率变化的结果。将小鼠分为5组，每组5到7只，其中3组进行酸灌注，并分别加注融合蛋白S1190-Fc、融合蛋白S318-510-Fc和对照Fc，2组进行盐灌注，并分别加注融合蛋白S318-510-Fc和对照Fc，每只灌注剂量为5.5nmol/kg融合蛋白或对照Fc。结果证明野生型小鼠酸灌注加注融合蛋白S1190-Fc组或融合蛋白S318-510-Fc组与酸灌注加注对照Fc组相比，在全部的测量时间内弹回率的变化具有显著性差异(p＜0.05)。证明在酸灌注条件下，S1190-Fc和S318-510-Fc都可以加重急性肺损伤。
图17是ACE2敲除小鼠肺部酸或盐灌注并加注融合蛋白S1190-Fc的肺弹回率变化的结果。过程与分组情况可参照图11的说明。结果证明在ACE2敲除的小鼠中，在酸灌注条件下，S1190-Fc和对照Fc对肺组织的弹回率的变化没有显著性差异。
图18腹膜内局部注射融合蛋白S1190-Fc后，可在肺组织匀浆中检测到S1190-Fc。用抗Fc的抗体通过Western blotting和蛋白G琼脂糖的方法可检测到融合蛋白S1190-Fc，对照的鼠的Fc则没有检测到。
图19是检测融合蛋白S1190-Fc的肺免疫组化的结果。结果表明，融合蛋白S1190-Fc聚积在支气管上皮细胞(左列，放大100倍)，炎性分泌细胞(中列，放大200倍)和肺泡细胞(右列，放大200倍)，这也是急性肺损伤容易发生的部位，证明S1190-Fc首先聚积在急性肺损伤部位。
图20用融合蛋白S1190-Fc处理过的野生型小鼠，肺组织ACE2蛋白表达量下降。分别用融合蛋白S1190-Fc和对照Fc蛋白处理野生型小鼠，然后用抗ACE2的抗体通过Western blotting的方法进行检测。结果证明S1190-Fc处理过的小鼠导致肺组织ACE2蛋白表达量下降。
图21是检测野生型小鼠肺组织的AngII水平的结果。将野生型小鼠用酸或盐灌注肺组织，并加注融合蛋白S1190-Fc或对照Fc蛋白，3小时后，用EIA测定肺组织Ang II的水平。结果证明在酸处理组，肺组织注入融合蛋白S1190-Fc与对照Fc蛋白的AngII的水平有明显差异(p＜0.05)，酸处理组并加注融合蛋白S1190-Fc的野生型小鼠肺组织AngII的水平明显增加，远高于酸处理过并加注对照Fc蛋白的小鼠的肺组织AngII的水平。
图22是小鼠用S1190-Fc免疫后，体内产生中和抗体的滴度(橙色)。将五周龄的雌性balb/c小鼠分为两组，每组5只，一组在0周、2周、4周注射50μg S1190-Fc加佐剂进行免疫，另一组注射同样剂量的Fc加佐剂作为对照(蓝色)，第六周采血收集血清。将热灭活的血清进行微量中和分析检测中和抗体的存在。结果证明，S1190-Fc组与对照组抗体滴度有明显差异，经S1190-Fc免疫后的小鼠能够产生大量有效的中和抗体，可有效阻止SARS-CoV的感染。
图23是S基因及其片段插入表达载体后酶切鉴定结果的电泳图。从左向右依次为λ-Hind III Marker，S317，S318-510，S318-1190，S511-1190，S685，S900，S1148，S1190，DL2000Marker。λ-Hind III Marker从小到大(从底端到上端)依次为564bp(此条带从图中较难分辨)，2027bp，2322bp，4361bp，6557bp，9416bp，23130bp；DL2000Marker从小到大(从底端到上端)依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。通过本图可以确定，S蛋白基因及其片段正确插入了表达载体。
图24是用Western Blotting的方法确定优化后的S融合蛋白及其截短形式在宿主细胞中表达的检测结果。从1-10分别为S1190-Fc，约为185KD；S1148Fc，约为180KD；S900Fc，约为175KD；S318-1190Fc，约为160KD；S511-1190Fc，约为155KD；S685Fc，约为155KD；S511Fc，约为140KD；S681-1190Fc，约为120KD；S317 Fc，约为85KD；S318-510-Fc，约为67KD。通过本图可以确定，优化后的S融合蛋白基因及其片段在宿主细胞中得到了较高量的表达，而优化前的原始序列在哺乳动物细胞中难以表达，证明了表达优化方法有效可行。
图25是细胞转染S317Fc与ACE2，gp120与ACE2未见融合的照片(放大100倍)。
图26是细胞转染S318-510-Fc与ACE2，S1190-Fc与ACE2发生融合的照片(放大100倍)。
图27是细胞转染S511-1190Fc与ACE2，S681-1190Fc与ACE2未见融合的照片(放大100倍)。
用293细胞分别转染上述S蛋白的几种截短形式与ACE2受体，或gp120(HIV表面蛋白)与ACE2受体，然后将转染24小时的两种细胞混合在一起，48小时拍照。以上六张照片说明，ACE2是SARS-CoV病毒的特异性受体，与ACE2发生作用并导致细胞融合的部分是S318-510，即S蛋白的318位到510位氨基酸。
以下将结合附图详细说明本发明。由此可见，本发明提供一种能够在哺乳动物细胞株中表达的SARS-CoV病毒S蛋白基因序列，例如本发明所述的序列SEQID NO1。
另外，本发明还提供一种含有SEQ ID NO1的重组表达质粒，所述的重组表达质粒优选包括真核PEAK系列。
本发明还提供经过能够在哺乳动物细胞株中表达的SARS-CoV病毒S蛋白基因序列表达出来的一种SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白，其结构为X-Y-Z其中X包括SARS-CoV病毒结构蛋白S或M或E或N，或以上结构蛋白的任意截短形式；Y是连接部分，由0-20个任何氨基酸组成；Z是包含铰链区、CH2、CH3结构域的人IgG1的Fc及其变体或蛋白标签。
由此可见，通过转染能够表达SARS-CoV病毒结构蛋白及其任意截短形式的融合蛋白及内源性二氢叶酸还原酶(endogenous dihydrofolate reductase，dhfr)的重组质粒，构建哺乳动物细胞表达株。
该重组质粒使用了强表达能力的哺乳动物真核细胞表达载体。利用更为强大的启动子，来启动基因的表达，使得SARS-CoV病毒结构蛋白及其截短形式在哺乳动物细胞表达系统中得到了高量表达。所述哺乳动物真核细胞表达载体可使用PEAK系列例如pEAK10、pEAK12、pEAK13等，pCDNA系列pCDNA3.0、pCDNA4.0等，pCDM系列pCDM7、pCDM8、pCDM10、pCDM12；优选的真核细胞表达载体是pEAK13；所述启动子选自CMV、EF1α、CoYMV、CMV enhancer+chicken albumin promoter、SV40 promoter+enhancer；优选的启动子是CMVenhancer+chicken albumin promoter。
本发明将目的蛋白序列前的分泌序列更换为公知的CD5蛋白的强引导序列(CD5L)，强化引导目的蛋白的分泌性表达。
为了使所表达的病毒蛋白能够与宿主蛋白和DNA有效分离，本发明采用分泌表达的载体，去除野生型SARS-CoV病毒结构蛋白基因前的原始的分泌序列，添加一段带有剪切信号的强大的引导序列CD5L，引导序列翻译后成为引导蛋白跨膜的信号肽，引导病毒结构蛋白穿过细胞膜，分泌到细胞外的培养基中，达到与宿主蛋白及DNA有效分离，简化蛋白提纯的步骤，降低蛋白提纯的难度，减小蛋白在提纯中变性的可能性的目的。并且引导序列翻译成的信号肽能够通过蛋白剪切酶的作用将其剪切下来，从而不影响病毒蛋白的结构。用CD5L序列替换野生型SARS-CoV病毒结构蛋白的分泌序列，如以下所示的序列5’ATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGAGCG 3’。
本发明将表达SARS-CoV病毒的结构蛋白的融合蛋白的质粒，其结构蛋白的编码基因进行人工合成，用人体细胞内常用(偏好)密码子替换病毒基因中编码相同氨基酸的密码子，对病毒的结构蛋白基因进行人类编码优化。
为使SARS-CoV病毒结构蛋白及其截短形式在哺乳动物细胞表达系统中的表达量更高，本发明还采用基因优化的手段。所述基因优化包括密码子人源化和最佳化。
所述密码子人源化是指多种生物都不同程度的存在密码子利用的差异及偏爱，由于本发明主要使用人源的细胞作为宿主，并且目的是应用于人体，因此将人体内极少被利用的密码子替换为人体内频繁被使用的偏爱密码子。
采用密码子最佳化的基因优化手段，是将融合蛋白的基因编码中表达宿主体内极少被利用的密码子替换为被频繁使用的密码子。通过GenBank查找出野生型SARS-CoV病毒S蛋白所对应的氨基酸序列，将每个氨基酸所对应的密码子更换为使用频率比例较高的密码子，从而得到若干优化DNA序列，以提高蛋白的表达量。
在本发明中，使用人体内氨基酸相对应的高效密码子替代稀有密码子，例如，甘氨酸(Gly)的密码子用GGC代替其它的GGA/GGT/GGG，谷氨酸(Glu)用GAG代替GAA，天冬氨酸(Asp)用GAC代替GAT等。
为清楚说明，下表中列出了密码子在人体内高表达基因中的使用频率。本发明按下列表中使用频率的比例进行密码子置换，将氨基酸所对应的密码子选择使用频率较高的密码子，提高了蛋白的表达效率。人体高表达基因中密码子使用频率比例如下


本发明用基因编码优化的方法，得到了若干优化的DNA序列，其中本发明优先选用的合成的SARS-CoV的S蛋白基因序列，如SEQ ID NO1所示。
本发明的转染重组质粒的真核细胞表达株选自CHO、293和Vero细胞株及其衍生细胞。
选择合适的能高量表达的宿主细胞株，建立表达细胞株，选用293细胞、CHO细胞或Vero细胞，以及以上细胞的衍生细胞(derivative)。利用构建的重组质粒中含有抗嘌呤霉素(puromycin)基因，筛选转染进S蛋白或其截短形式的基因的细胞，最后用ELISA或Western Blotting的方法进行定量定性，挑选出最优表达株。其中，293E，293ET及CHO细胞表达量较高，尤其以CHO细胞为最佳。将挑选出的高量恒定表达细胞株进行细胞驯化培养，进一步提高病毒蛋白的表达量，为批量制备及产业化生产提供条件。
本发明中所涉及的相关哺乳动物细胞表达株已经于2005年7月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏号分别为1408、1409、1410。
本发明构建真核细胞表达株所用的筛选药物是嘌呤霉素(puromycin)，细胞驯化提高蛋白表达量所用的药物为氨甲蝶呤(methotrexate)。
本发明构建的重组质粒选用了抗嘌呤霉素(puromycin)的基因，嘌呤霉素(puromycin)是一种可以杀伤真核细胞的药物。将细胞转染进带有抗嘌呤霉素(puromycin)的基因的重组质粒后，可以提高细胞对嘌呤霉素的耐受性。在细胞培养基中梯度加入嘌呤霉素(puromycin)，利用含有抗嘌呤霉素基因的细胞与不含该基因的细胞对嘌呤霉素的耐受性的差异，可以用来筛选转染成功的哺乳动物细胞。该重组质粒中还存在二氢叶酸还原酶(endogenous dihydrofolate reductase；dhfr)基因，因此，氨甲蝶呤(methotrexate)可用来进行细胞驯化，提高蛋白表达量高。
本发明所表达的SARS-CoV病毒的全长的结构蛋白的融合蛋白(E-Fc，M-Fc，N-Fc，S-Fc)如图1所示。本发明所表达的SARS-CoV病毒的S蛋白及其任意截短形式的融合蛋白(317-Fc，511-Fc，685-Fc，900-Fc，1148-Fc，1190-Fc，318-510-Fc，318-1190-Fc，511-1190-Fc和681-1190-Fc)如图23和图24所示。
而细胞表达株的构建则避免了细胞瞬时转染状态的不稳定，并可以通过选择表达优势株进行扩增来提高产量，还可以通过细胞驯化等手段来进一步提高表达量，从而实现蛋白的批量制备或产业化生产。
此质粒的具体构建过程见实施例1和2，细胞表达株的构建过程见实施例3。
(2)细胞表达株在正常生长状态下每24小时每百万细胞在其培养基中产生10μg以上重组蛋白。将细胞计数后，进行培养，三天后收集细胞培养用的培养基，通过ELISA的方法检测细胞株的表达量，通过计算，得到S蛋白及S蛋白的一系列截短形式的表达量。用本发明的方法，最终可以得到高表达量的多种SARS-CoV病毒的结构蛋白及其截短形式蛋白的融合蛋白。在细胞的培养基中，表达量高于10μg/106细胞/24小时。其中S1190-Fc(去掉跨膜区的全长的S蛋白)产量高于10μg/106细胞/24小时；S截短形式蛋白(S318-510-Fc)产量可高于30μg/106细胞/24小时。
(3)纯化通过步骤(2)表达的蛋白。由于是分泌性表达，简化了蛋白纯化的步骤，减小蛋白提纯中变性的可能性，并能够与宿主蛋白及DNA有效分离。将目的蛋白用亲和柱和分子筛提纯后，其纯度可达99％以上。如图4所示。并为高效液相色谱-质谱实验所验证。
具体步骤见实施例10。
本发明所表达提纯的蛋白具有其在生物机体内相应的生物活性。例如，本发明所表达提纯的S1190-Fc可与S蛋白的受体ACE2结合，如图5，图6，图7，和图9所示。S1190-Fc亦可与具有其受体的细胞融合并进入细胞，如图8，图10，和图11所示。
本发明所表达纯化的融合蛋白可以用来制备疫苗，防止SARS-CoV病毒的感染。
本发明通过对S蛋白的一系列优化，完成了S蛋白及S蛋白的一系列截短形式的表达，并对其各部分的功能进行了研究，得到了大量的结果与数据，对S蛋白及其不同截短形式的应用提供了依据。本发明进一步完成了S蛋白与ACE2相互作用的细胞实验及体内实验，发现了S蛋白可导致ACE2表达的下调，并且ACE2的下调可加剧急性肺损伤。本发明并通过进一步的实验证明，其主要结合ACE2受体并引起ACE2受体下调的位点为S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸。因此在制备疫苗时，需要去掉此段氨基酸序列或者对S蛋白进行突变或修饰使其不能结合ACE2受体或降低与ACE2受体结合能力，尤其是对S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸的突变与修饰，以防止引发一系列的病理过程；可挑选具有合适免疫原性，能引发机体适当的细胞免疫反应及体液免疫反应，产生有效地中和抗体的S蛋白的截短形式或S蛋白的不同突变体或修饰后产物来制备疫苗，从而预防SARS-CoV病毒的感染。
本发明所表达纯化的融合蛋白免疫小鼠，可产生中和SARS-CoV病毒的高效中和抗体。
五周龄的雌性balb/c小鼠分为两组，每组5只，一组在0周、2周、4周注射50μg S1190-Fc加佐剂进行免疫，另一组注射同样剂量的Fc加佐剂作为对照，第六周采血收集血清。将热灭活的血清进行微量中和分析检测中和抗体的存在。将热灭活的血清进行双重稀释后，用微量中和分析检测中和抗体的滴度。在96孔板中梯度加入中和抗体，每个梯度加三个孔，然后每个孔加入SARS-CoV感染Vero E6单层贴壁细胞的TCID50剂量的100倍，第三天和第四天检测病毒致细胞病变影响(CPE)，用RM公式计算在50％的孔中能够完全抑制CPE的梯度，最后得到中和抗体的滴度。本发明结果证明，S1190-Fc组与对照组抗体滴度有明显差异，经S1190-Fc免疫后的小鼠能够产生大量有效的中和抗体，可有效阻止SARS-CoV病毒的感染。具体步骤见实施例11。结果如图22所示。本发明说明，S蛋白的任意截短形式的融合蛋白免疫小鼠可产生不同效价的SARS-CoV病毒的中和抗体，不同程度阻止SARS-CoV病毒的感染。
本发明的融合蛋白可以用来制备病毒检测试剂盒。
用本发明所得到的病毒结构蛋白及其不同截短形式作为一种检测SARS-CoV病毒的新试剂，来检测血液中相应抗体的存在，以确定是否存在SARS-CoV病毒感染的可能性。本发明通过动物实验验证了S蛋白的强免疫原性，可作为检测性抗原检测血液中的相应抗体。将在哺乳动物宿主细胞系统中表达出来的具有抗原性的，能与人体内抗SARS-CoV病毒的相应抗体发生反应的蛋白进行提纯后，连接到酶标板上，利用ELISA的相关原理，制成检测试剂盒。当人体感染SARS-CoV病毒后，血液中出现的相应抗体可吸附连接到酶标板上的S蛋白，经过标记性抗体的进一步反应，从而呈现阳性结果被检测出来，从而协助诊断。
本发明的融合蛋白可以用来制备或筛选抗SARS-CoV感染的药物。
本发明所得到的S蛋白还可用于筛选治疗性药物。SARS-CoV病毒的致病机理主要是通过S蛋白与受体ACE2的相互作用实现，因此，在筛选抗SARS-CoV病毒的药物时，可选择能够抑制S蛋白与ACE2受体的结合的药物，包括小分子化合物、多肽和基因工程药物，从而抑制SARS-CoV病毒侵入细胞。本发明已经证明通过小鼠体内注射S1190蛋白，小鼠可产生大量的中和抗体，产生的抗体可抑制100倍的SARS-CoV病毒感染Vero E6细胞的TCID50。
本发明的融合蛋白可以用来制备防止SARS-CoV病毒感染的抗体。
本发明所得到的S蛋白还可用于筛选单克隆抗体，尤其是人源化单克隆抗体，筛选出的单克隆抗体可以特异性的与S蛋白结合，从而阻止S蛋白与受体ACE2的结合，因此，可用作SARS的治疗药物，或对人群进行被动免疫。
本说明书中所述SARS-CoV病毒结构蛋白的氨基酸序列来源于GenBankNC_004718。
此外，本发明还涉及一种去除、修饰或者突变表达SARS-CoV病毒结构蛋白S第318位氨基酸到510位氨基酸任意氨基酸片段，或者去除、修饰或突变表达SARS-CoV病毒结构蛋白S第318位氨基酸到510位氨基酸片段序列的DNA序列，以及所述的DNA序列表达的氨基酸。
本发明还涉及所述的DNA序列或者所述的DNA表达的氨基酸在制备预防SARS-CoV病毒的疫苗中的用途。所述的疫苗包括DNA载体疫苗，蛋白疫苗，病毒载体疫苗。
由此获得的DNA序列或者氨基酸其目的都是为使所述SARS-CoV病毒结构蛋白S不能与受体ACE2结合或降低与ACE2结合能力。
急性呼吸窘迫综合症(ARDS)是各种急性肺损伤中最为严重的一种。急性呼吸窘迫综合症是以血管通透性增强导致的肺水肿，炎症细胞的增加和严重缺氧为特征的。ARDS的诱病因素是多种多样的，包括败血症，吸入性的，以及由SARS冠状病毒或禽/人流感病毒引发的肺炎。本发明的实验数据显示急性肺损伤包括小鼠体内感染SARS会导致一个肾素血管紧张素系统中一个重要的酶--ACE2的明显下降。损伤导致的肾素血管紧张素体系失调，导致了平衡向AngII增加的方向移动。ACE2和肾素血管紧张素体系的这个全新角色似乎与其血管紧缩作用无关，而与血管渗透性的调节相联联。尽管ACE2的其他代谢产物，例如缓激肽，可能在体内发挥着重要的作用，本发明的实验的数据提供了ACE2是通过AngII来发挥它调节作用的第一个证据。
肾素-血管紧张素系统(RAS)对于维持血压稳定，水电介质平衡起着非常重要的作用。血管紧张素转换酶2(ACE2)与ACE有同源性，是RAS系统的负调性成分。有趣的是，体内实验性SARS病毒感染可导致小鼠肺脏ACE2表达明显下降。尽管人和小鼠肺脏都表达ACE2，但有关肺中ACE2的功能还一无所知。为了弄清ACE2在急性肺损伤和肺脏功能衰竭中的作用，我们在实验模型中检测ace2缺失的影响。这个模型再现了在许多人疾病如败血症、酸吸入、及SARS和禽流感病毒A型感染导致的急性肺损伤中常见的肺功能衰竭的病理表现。
发明人发现S蛋白与ACE2的结合可导致ACE2在机体内表达的下调，如图10，图11，和图20所示，并且ACE2的下调通过肺部的RAS系统的信号传导途径可引起或加剧急性肺损伤，如图12，图13，图14，图15，图16，图17，图18，图19，和图21所示。
抗Fc的抗体和培养细胞株的实验发现ACE2受体下调。将Vero E6细胞分别在4℃(篮线)和37℃(红线)与融合蛋白S1190-Fc充分作用，同时用Fc作为对照(黑线)，然后用抗Fc的抗体进行检测。本发明人发现，在37℃时，融合蛋白S1190-Fc与受体ACE2相互作用，并导致ACE2受体下调。如图10所示。
抗ACE2的抗体和培养细胞株的实验发现ACE2受体下调。将Vero E6细胞分别在4℃(篮线)和37℃(红线)与融合蛋白S1190-Fc充分作用，同时用Fc作为对照(黑线)，然后用抗ACE2的抗体进行检测。本发明人发现，在37℃时，融合蛋白S1190-Fc与受体ACE2相互作用，并导致ACE2受体下调。如图11所示。
融合蛋白S1190-Fc处理过的野生型小鼠，其肺组织ACE2蛋白表达量下降。分别用融合蛋白S1190-Fc和对照Fc蛋白处理野生型小鼠，然后用抗ACE2的抗体通过Western blotting的方法进行检测。本发明人发现，S1190-Fc处理过的小鼠导致肺组织ACE2蛋白表达量下降。如图20所示。
野生型小鼠肺部酸或盐灌注并加注融合蛋白S1190-Fc导致肺弹回率变化。将小鼠分为4组，每组5到7只，两组进行酸灌注，并加注融合蛋白S1190-Fc和对照Fc，两组进行盐灌注，同样加注融合蛋白S1190-Fc和对照Fc，每只小鼠灌注剂量为5.5nmol/kg融合蛋白S1190-Fc或5.5nmol/kg对照Fc。结果证明野生型小鼠酸灌注加注融合蛋白S1190-Fc组与酸灌注加注对照Fc组相比，在全部的测量时间内弹回率的变化具有显著性差异(p＜0.05)，酸灌注加注融合蛋白S1190-Fc组肺弹回率变化幅度明显高于酸灌注加注对照Fc组。如图12所示。本发明人发现，在酸灌注条件下，融合蛋白S1190-Fc加重急性肺损伤。
图13是小鼠肺组织病理切片。将图1
中同样处理的小鼠肺组织制成病理切片，结果与图1
中所述结果吻合。在酸灌注条件下，肺组织出现明显水肿，发生急性肺损伤，与对照Fc相比，加入了融合蛋白S1190-Fc后明显加剧了急性肺损伤的程度。
图14是肺损伤评分结果。此结果印证了图12和图13的结果，证明在酸灌注条件下，肺组织发生急性肺损伤，与对照Fc相比，加入了融合蛋白S1190-Fc后明显加剧了急性肺损伤的程度，两者具有显著性差异(p＜0.01)。
图15是湿干肺组织重量比的结果。此结果印证了图12、13、14的结果。证明在酸诱导的急性肺损伤的情况下，相较于对照Fc组，加入融合蛋白S1190-Fc组所造成的肺水肿程度更为严重，湿干肺组织重量比更大，与对照Fc组相比具有显著性差异(p＜0.05)。
野生型小鼠肺部酸或盐灌注并加注融合蛋白S1190-Fc或融合蛋白S318-510-Fc导致肺弹回率变化。将小鼠分为5组，每组5到7只，其中3组进行酸灌注，并分别加注融合蛋白S1190-Fc、融合蛋白S318-510-Fc和对照Fc，2组进行盐灌注，并分别加注融合蛋白S318-510-Fc和对照Fc，每只灌注剂量为5.5nmol/kg融合蛋白或对照Fc。结果证明野生型小鼠酸灌注加注融合蛋白S1190-Fc组或融合蛋白S318-510-Fc组与酸灌注加注对照Fc组相比，在全部的测量时间内弹回率的变化具有显著性差异(p＜0.05)。如图16所示。本发明人发现，在酸灌注条件下，S1190-Fc和S318-510-Fc都可以加重急性肺损伤。
ACE2敲除小鼠肺部酸或盐灌注并加注融合蛋白S1190-Fc导致肺弹回率变化。过程与分组情况可参照图12的说明。结果显示，在ACE2敲除的小鼠中，在酸灌注条件下，S1190-Fc和对照Fc对肺组织的弹回率的变化没有显著性差异，如图17所示。本实验说明；S1190-Fc是通过与ACE2的结合引起或导致急性肺损伤。
腹膜内局部注射融合蛋白S1190-Fc后，可在肺组织匀浆中检测到S1190-Fc。用抗Fc的抗体通过Western blotting和蛋白G琼脂糖的方法可检测到融合蛋白S1190-Fc，对照的鼠的Fc则没有检测到。如图18所示。
融合蛋白S1190-Fc在小鼠肺部的定位。免疫组化结果表明，融合蛋白S1190-Fc聚积在支气管上皮细胞(左列，放大100倍)，炎性分泌细胞(中列，放大200倍)和肺泡细胞(右列，放大200倍)，这也是急性肺损伤容易发生的部位，发现S1190-Fc首先聚积在急性肺损伤部位。如图19所示。
S1190-Fc对野生型小鼠肺组织的AngII水平的影响。将野生型小鼠用酸或盐灌注肺组织，并加注融合蛋白S1190-Fc或对照Fc蛋白，3小时后，用EIA测定肺组织AngII的水平。结果证明在酸处理组，肺组织注入融合蛋白S1190-Fc与对照Fc蛋白的AngII的水平有明显差异(p＜0.05)，酸处理组并加注融合蛋白S1190-Fc的野生型小鼠肺组织AngII的水平明显增加，远高于酸处理过并加注对照Fc蛋白的小鼠的肺组织AngII的水平，如图21所示。
上述实验结果说明S1190通过与ACE2受体结合并下调ACE2，引起或加剧急性肺损伤，其主要结合ACE2受体并引起ACE2受体下调的位点为S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸。S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸的片段本身即可引起或加剧急性肺损伤，因此在制备疫苗时，需要去掉或修饰此段氨基酸序列。
所述SARS-CoV病毒结构蛋白S的截短形式包括去除了第318位氨基酸到510位氨基酸的任意截短形式。根据国际上已经发表的文献可知，ACE2是SARS-CoV病毒结构蛋白S的受体。本发明通过S蛋白与ACE2相互作用的细胞实验及体内实验，发现了S蛋白可导致ACE2的下调，并且ACE2的下调可加剧急性肺损伤。本发明并通过进一步的实验发现，其主要结合ACE2受体并引起ACE2受体下调的位点为S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸。因此在制备疫苗时，需要去掉或修饰此段氨基酸序列，防止引发一系列的病理过程；可挑选具有合适免疫原性，能引发机体适当的细胞免疫反应及体液免疫反应，产生有效地中和抗体的S蛋白的截短形式(已去掉或修饰此段氨基酸序列)来制备疫苗。
SARS-CoV病毒结构蛋白S包括通过突变或修饰使其不能结合ACE2受体或降低与ACE2受体结合能力的S蛋白及其任意截短形式。本发明证实，ACE2下调可导致机体急性肺损伤进一步恶化等病理过程，并且主要结合ACE2受体并引起ACE2受体下调的位点为S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸。所以在制备疫苗时，需要对S蛋白进行突变或修饰使其不能结合ACE2受体或降低与ACE2受体结合能力，尤其是对S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸的突变与修饰。通过突变与修饰，可以即保持较好的免疫原性，能够引起机体的细胞免疫与体液免疫，又不至于引发机体的病理损伤。因此，通过对S蛋白进行突变或修饰，使其不能结合ACE2受体或降低与ACE2受体结合能力，也是制备基因工程疫苗的一条重要的途径。
图25是细胞转染S317Fc与ACE2，gp120与ACE2未见融合的照片(放大100倍)。
图26是细胞转染S318-510-Fc与ACE2，S1190-Fc与ACE2发生融合的照片(放大100倍)。
图27是细胞转染S511-1190Fc与ACE2，S681-1190Fc与ACE2未见融合的照片(放大100倍)。
用293细胞分别转染上述S蛋白的几种截短形式与ACE2受体，或gp120(HIV表面蛋白)与ACE2受体，然后将转染24小时的两种细胞混合在一起，48小时拍照。以上六张照片说明，ACE2是SARS-CoV病毒的特异性受体，与ACE2发生作用并导致细胞融合的部分是S318-510，即S蛋白的318位到510位氨基酸。S蛋白的其他截短形式，去掉或修饰S318-510片段，不会与ACE2发生作用并导致细胞融合，也不会引起或加剧急性肺损伤，是比较安全的候选疫苗。
本发明说明，对S蛋白进行突变或修饰，尤其是对S蛋白第318位氨基酸到510位氨基酸进行去除，突变与修饰，使其不能结合ACE2受体或降低与ACE2受体结合能力，在其中挑选具有对SARS-CoV病毒高效体液免疫和细胞免疫的S蛋白截短形式，是制备高效安全的抗SARS-CoV病毒疫苗的需要。
本发明涉及的所述的DNA序列或者所述的DNA表达的氨基酸在制备预防SARS-CoV病毒的疫苗中的用途。所述的疫苗包括DNA载体疫苗，蛋白疫苗，和病毒载体疫苗。
具体实施例方式实施例1 SEQ ID No1的全基因人工合成SEQ ID No1的全基因采用现有技术公知的基因合成方法，委托上海(中国)博亚生物技术有限公司人工合成。
公知的全基因人工合成方法采用相互对应的100个碱基的寡核苷酸引物及相应PCR扩增引物，寡核苷酸引物两两部分有20个碱基重叠，构成完整基因，经过连接，退火，PCR扩增，合成全基因。
实施例2 质粒构建及鉴定(1)PCR产物的获得A引物设计及合成S317forword5’GGCGCTAGCCAGCGACCTGGACCGCTGC3’
reverse5’CGCGGATCCGTCGGGGAAGCGCACGACGTC3’S510forword5’GGCGCTAGCCAGCGACCTGGACCGCTGC3’reverse5’CGCGGATCCGTCACGGTGGCGGGGGCGTTC3’S685forword5’GGCGCTAGCCAGCGACCTGGACCGCTGC3’reverse5’CGCGGATCCGTGGCGCCCAGGCTCATGGTG3’S900forword5’GGCGCTAGCCAGCGACCTGGACCGCTGC3’reverse5’CGCGGATCCGTCTCGTACAGCACGTTCTG3’S1148forword5’GGCGCTAGCCAGCGACCTGGACCGCTGC3’reverse5’CGCGGATCCGTCAGGTCCACGTCGGGGCTG3’S1190forword5’GGCGCTAGCCAGCGACCTGGACCGCTGC3’Reverse5’CTCACATGTATGGATCCTTCTGCTCGTACTTGCCCAG3’S318-510forword5’GGCGCTAGCCATCACCAACCTGTGCCCC3’reverse5’CGCGGATCCGTCACGGTGGCGGGGGCGTTC3’S318-1190forword5’GGCGCTAGCCATCACCAACCTGTGCCCC3’reverse5’CTCACATGTATGGATCCTTCTGCTCGTACTTGCCCAG3’S511-1190forword5’GGCGCTAGCCTGCGGGCCCAAGCTGAGC3’reverse5’CTCACATGTATGGATCCTTCTGCTCGTACTTGCCCAG3’S681-1190forword5’GGCGCTAGCCcTGGGCGCCGACAGCAGC3，reverse5’CTCACATGTATGGATCCTTCTGCTCGTACTTGCCCAG3’以上引物均由上海(中国)博亚生物技术有限公司合成BPCR扩增产物使用PCR仪(eppendorf Mastercycler，Germany)进行扩增反应引物(1μg/μl)0.5μl模板PUC18S 1μg(用限制性内切酶ECoR137℃酶切孵育一小时后)PCR扩增试剂盒(2×pfu PCR Master Mix，CatNoKP-201，北京天为时代科技有限公司)按试剂盒说明使用，加至50μl反应体系。首先变性温度94℃5分钟，然后进入如下30-40个循环，变性温度94℃1分钟，退火温度55℃30秒，延伸反应72℃1-2分钟，循环反应结束时，再给予72℃10分钟的延长反应。
所得PCR产物取5μl，用1％琼脂糖凝胶(Agarose，TED&HY Bio CoLtd CatNOA9918)电泳检测。
检测正确的PCR产物用PCR clean-up kit试剂盒(VITAGENE，CatNo110310-05)纯化，所得纯化产物用25μl TE(分子克隆实验指南第二版)溶解保存。
(2)插入片段的合成CD5L-top5’AATTCGCCGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGAGCGCTAGCATC3’CD5L-bottom5’CATGGATGCTAGCGCTCCGAGGCAGGAAGCGACCAGCATCCCCAGCAGGTACAAGGTGGCCAGCGGTTGCAGAGACCCCATGGGCATGGTGGCGGCG3’由上海博亚生物技术有限公司合成上述序列。
Fc段序列来源于GenBank中的人源IgG Fc段DNA序列，由上海博亚生物技术有限公司进行合成。
(3)质粒构建及初步检测A首先将合成的单链复性成双链，作为插入片段。
B构建重组载体pEAK13 CD5L Fc载体pEAK13插入片段CD5L、Fc段我们以pEAK13作为载体，用限制性内切EcoRI、NotI消化，然后连接、转化、检测(具体过程如下述)，得到质粒pEAK13 CD5L FcC构建重组载体pEAK13 CD5L Fc DR载体pEAK13 CD5L Fc插入片段DR(内源性二氢叶酸还原酶基因)片段来源本实验室保存的其它含有该基因的质粒。
先用限制性内切酶Pst I、Bgl II将插入片段DR从其载体上消化下来。然后以pEAK13 CD5L Fc作为载体，用限制性内切酶Pst I、Bgl II消化，然后连接、转化、检测(具体过程如下述)，得到质粒pEAK13 CD5LFc DRD构建含有优化后的S蛋白基因及其片段的重组载体载体pEAK13 CD5L Fc DR插入片断PCR产物S317，S511，S685，S900，S1148，S1190，S318-510，S318-1190，S511-1190，S681-1190。
a酶切消化在限制性内切酶缓冲体系中加入载体DNA或PCR产物消化1-3小时。消化体系总体积20μl，加入1μg DNA，2μl10×BSA(0.1％BSA)，2μl10×NEB Buffer，0.5μl限制性内切酶Nhe I和BamH I(所有限制性内切酶，0.1％BSA，NEBBuffer均购自NEW ENGLAND BioLabsInc，USA)，载体DNA的消化体系需另外加入0.5μl的碱性磷酸酶(Promega，USA，CatNoM182A)使载体消化末端去掉磷酸基团。
倒1.5％的低熔点胶(Promega，USA，Cat Nov2111)8.5ml在放有梳子的电泳玻璃片(75×50mmPre-Cleaned Micro Slides Plain，corning，USA，No2974)上，等其冷却凝固。
胶固化后拔去梳子，置于电泳槽，加入含有500μg/L Ethidium Bromide(Promega，USA，Cat#H5041)的TAE缓冲液(《分子克隆实验指南》第二版)，在加样孔中各加15-20μl的消化后的载体DNA和消化后的PCR产物。同时加DNA Marker如λ-Hind III，DL2000(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)以确定DNA的片段大小。
电泳60-80V(电泳仪DYY-6C型，北京六一仪器厂)，20-60分钟。
将电泳后的胶移到紫外线(UV-IV紫外分析仪，北京市新技术应用研究所)下，照相，并切下需要的DNA条带。
将切下的含有所需DNA条带的胶置于1.5ml离心管中，短暂高速离心使胶落到管底，65℃加热使胶融化。
b连接准备连接缓冲体系40μl加5μl 10×NEB Buffer 4，2μl 100×BSA，5μl 10×Ligation Additions，0.5μl T4DNA连接酶，2-4μl载体DNA，去离子水补足总体积至40μl(T4DNA连接酶，100×BSA，NEB Buffer均购自NEW ENGLANDBioLabsInc，USA)。
将连接体系均分两份(各20μl)，在其中一份连接体系中加2-4μl含有待插入DNA片段的胶，另一份加入相应体积的去离子水作阴性对照(在连接体系中载体和插入DNA量保持在1∶2左右，20μl体系1.5％的低熔点胶的总体积不超过6μl)。
混匀，室温1-3小时。
转化感受态细胞MC1061(由本实验室制备，制备方法见《分子克隆实验指南》第二版化学感受态细菌制备的实验方法)。
c转化从-70℃冰箱中取出化学感受态细胞置于冰上融化。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养皿(《分子克隆实验指南》第二版试剂配制方法，氨苄青霉素(华北制药厂，中国)的琼脂表面倒上不含氨苄青霉素的LB琼脂5-6ml，凝固后使用。
在感受态细胞刚刚融化后，马上加入连接产物和阴性对照，每100μl化学感受态细菌加入5-8μl的体积，轻轻混匀，置于冰上15-30分钟。
37℃水浴5分钟。
将细胞悬液吸出，均匀铺在刚刚加入LB培养基的培养皿中，37℃培养12-16小时，可长出单克隆菌落。
d鉴定将单克隆菌落用牙签挑到4ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃摇床(台式恒温振荡器THZ-D，培英)，250-280rpm，摇7-8小时使菌液长至饱和。
使用质粒小提试剂盒(北京天为时代科技有限公司，DP-103)，根据其提供的方法提取质粒DNA。
小提所得的质粒溶于50-60μlTE，取10μl用限制性内切酶Nhe I和BamHI酶切消化检测，挑出酶切检测正确的质粒所对应的菌株。
e测序将酶切检测正确的质粒进行测序(上海博亚生物技术有限公司及上海生工生物工程技术服务有限公司)，进行进一步的确认。
f质粒的大量提取用CsCl密度梯度离心法大量提取重组后的质粒(实验方法见《分子克隆实验指南》第二版)。
E转染细胞，确定融合蛋白的高量正确表达。
计数2×105个细胞分到6孔细胞培养板的每个孔，24小时后，分别用脂质体(lipofectamineTM2000购自InvitrogenTM)转染构建好的含有S蛋白及其不同截短形式的重组质粒。收集培养3天和6天的培养基，用Western Blotting方法和细胞流式技术进行检测。用Western Blotting方法检测融合蛋白分子量的大小，用细胞流式技术检测融合蛋白的活性(具体操作方法如下述)。
实施例3建立恒定表达细胞株(1)用限制性内切酶AvrII(购自NEW ENGLAND BioLabsInc，USA)酶切大约10μg的重组质粒，取少量酶切产物电泳确定酶切完全后，将剩余的酶切产物用纯化试剂盒(购自V-Gene公司)进行纯化，回收DNA，去除其中的酶及蛋白等。
(2)用胰酶消化细胞，加入培养基，吹打成单个细胞。计数2×105个细胞分到6孔细胞培养板的每个孔。
(3)24小时后，分别用脂质体(lipofectamineTM2000购自InvitrogenTM)转染水(阴性对照)及0.5μg酶切纯化后的DNA(根据试剂盒提供的操作方法进行操作)。
(4)48小时后分至12孔细胞培养板(每个6孔细胞培养板的孔的细胞均分到4个12孔细胞培养板的孔)，梯度加入不同浓度的筛选药物puromysin(购自CALBIOCHEMCLONTECH)，杀死未转入DNA的细胞。
(5)72小时后，选择阴性对照全部死亡，转染DNA的细胞有适量存活的药物浓度所对应的细胞。将孔内细胞用有限稀释法分单个细胞到细胞培养用96孔板。
(6)等待10天左右，挑选细胞单克隆，用ELISA及Western Blotting方法进行检测。
用Western Blotting方法进行检测，确定蛋白分子量的大小，从而确定基因的正确表达。用ELISA试剂盒检测蛋白的浓度，选取能进行高量表达的细胞系。用细胞流式技术检测蛋白的活性(具体操作方法如下述)。
实施例4用Westerrn Blotting的方法检测融合蛋白的分子量所用电泳、转膜装置及试剂电泳仪(PowerPac BasicTMPower Supply)购自BIO-RAD，Catalogumber164-5050电泳装置(Mini-PROTEANu3Cell)购自BIO-RAD，CatalogNumbers165-3301.165-3302电转膜装置(Mini Trans-BlotElectrophoretic Transfer Cell)购自BIO-RAD，Catalog Numbers170-3930.170-3935试剂均购自SIGMA-ALDRICHCORPORATION·BOX14508·ST.LOUIS·MISSOURI 63178·USA样品来源取自转染细胞的培养基、构建好的细胞株的培养基以及纯化的蛋白。
操作方法电泳上样前将样品加入到等体积的2×电泳加样缓冲液(配制方法参见分子克隆试验指南第二版第890页科学技术出版社)中，97℃，加热5分钟。
灌制SDS聚丙烯酰胺凝胶。分离胶浓度10％，浓缩胶浓度5％(配制方法参见分子克隆试验指南第二版第883-884页科学技术出版社)。
将灌胶玻璃板从固定框架上取出，按说明书安装到电泳装置中，用1×电泳缓冲液(配制方法参见分子克隆试验指南第二版第884页科学技术出版社)注满整个电泳盒。
用枪头小心的将15μl预先经过加热变性的样品(含7.5微升上清，7.5微升加样缓冲液)依次注入到凝胶加样孔内。
按说明书正确连接电泳装置，接通电源。
开始电泳，起始电压为80V，当溴酚兰染料前端进到分离胶后，提高电压至120V继续电泳，直至溴酚兰染料达到分离胶底部或全部泳出凝胶，关闭电源(大约需要120分钟)。
配制1升转膜缓冲液(配制方法参见分子克隆试验指南第二版第892页科学技术出版社)，并置于4℃预冷。
电泳结束后，切断电源打开电泳盒，将内盒中的玻璃板取出，切去浓缩胶，转移分离胶于预先注入转膜缓冲液的容器中。
戴上手套切一块略大于分离胶的硝酸纤维素膜(Amersham，CatalogNoRPN303C)，再切两块同样大小的滤纸，将硝酸纤维素膜，滤纸和两块海绵分别浸于三个盛有转膜缓冲液的容器中。
按照转膜仪说明书，安装转膜装置。转膜条件恒定电流300毫安，时间120分钟。
转膜结束后将膜小心取出，置于盛有2％鸡卵清封闭液(SIGMAALBUMIN，CHICKEN EGG，Catalog numberA-5253)的容器里，在平缓摇动的摇床上室温封闭1小时(或4℃，过夜)。
封闭结束后，弃去封闭液，用2％鸡卵清封闭液稀释一抗加入，室温结合3小时或4℃过夜。
一抗结合结束后，用TBST洗膜3次，每次10分钟。
弃去TBST，用2％鸡卵清封闭液稀释二抗加入，室温结合1到2小时(对于Fc等直接可用二抗的蛋白标签，封闭完后，直接加入封闭液稀释的二抗进行结合)。
抗体结合结束后，用TBST洗膜3次，每次10分钟。
按照说明书配制Western检测显色液(Santa Cruz Biotechnology，Inc.CatalogNumbersc-2048)，并将配制好的Western检测显色液均匀滴加于膜结合蛋白的一侧。
吸尽过多的Western检测显色液，用保鲜膜小心的将膜包好，置于X射线摄影暗匣(中国汕头市粤华医疗器械厂有限公司型号AX-II，规格127×178mm)中。
暗室中，将胶片置于暗盒中曝光，然后显影4-5分钟，定影4-5分钟。(胶片为Kodak X-Omat BT Film，由中国汕头柯达股份有限公司分装，美国伊士曼柯达公司制造。规格12.7×17.8cm，乳剂编号031222104)(显影粉与定影粉购自天津河北感光材料厂)通过对细胞单克隆上清进行Western Blotting定性检测，我们检测到了跟预期大小相符的条带。
实施例5用ELISA的方法检测融合蛋白的表达量培养基中含有的蛋白的浓度可用ELISA的方法予以检测。ELISA所用试剂为BD Biosciences公司的BD PharmingenTMELISA试剂盒。
ELISA检测方法如下(1)将细胞上清液、阴性对照(加入牛血清的培养基)、阳性对照及标准(呈梯度稀释的已知浓度的人的IgG抗体，用于蛋白定量)加入96孔酶标板，每孔100μl，过夜。每个样品加三个孔，以鉴定区别阳性结果与污染所致的假阳性结果。
(2)次日，将96孔板中的培养液吸出，用洗液(wash solution)洗一次，每孔200μl。
(3)加入分析液(assay diluent)，每孔200μl，在摇床上室温摇1小时。
(4)加入分析液稀释的一抗，每孔100μl，在摇床上室温摇3小时。
(5)一抗结合结束后，用洗液洗3次，每孔200μl(6)加入用分析液稀释的HRP标记的二抗(对于Fc等直接可用二抗的蛋白标签，用分析液结合完后，直接加入分析液稀释的二抗进行结合)，每孔100μl，室温下摇一小时。
(7)用洗液洗八遍，200μl每孔。
(8)将等体积的感光剂A、B(substrate reagentA/B)混匀，避光。将洗完八遍的酶标板加入混匀后的感光剂，每孔100μl，常温避光30分钟。
(9)30分钟后加入终止液(stop solution)，每孔50μl，终止反应。
(10)酶标仪450nm读数。
(11)根据读数，计算蛋白含量。
经检测，以每百万细胞在24小时的表达量计，S蛋白及其截短形式蛋白的表达量都在10μg以上。融合蛋白S1190-Fc在上清中的表达量可达10μg以上，融合蛋白S1148Fc在上清中的表达量可达20μg以上，融合蛋白S900Fc在上清中的表达量可达20μg以上，融合蛋白S685Fc在上清中的表达量可达20μg以上，融合蛋白S511Fc在上清中的表达量可达20μg以上，融合蛋白S317Fc在上清中的表达量可达20μg以上，融合蛋白S318-1190Fc在上清中的表达量可达10μg以上，融合蛋白S318-510-Fc在上清中的表达量可达30μg以上，融合蛋白S511-1190Fc在上清中的表达量可达10μg以上，融合蛋白S681-1190Fc在上清中的表达量可达10μg以上。
实施例6用流式细胞技术检测表达蛋白的活性已知Vero E6细胞存在S蛋白的受体ACE2，该受体主要与S蛋白第318位到510位氨基酸作用。利用受体与配体相互结合的特性，可以确认蛋白的正确折叠，即构象正确。
流式检测方法(1)将Vero E6细胞或转染了ACE2的293细胞用PBS/2mMEDTA消化下来，均分为若干份，置于离心管中。
(2)离心(Eppendorf Centrifuge 5415D)，1000rpm，10min。
(3)用含有S蛋白或其截短形式的细胞培养基分别重悬细胞，用加入血清(购自Hyclone)后的IMDM(购自GIBCO)培养基作为阴性对照。
(4)4℃旋转混匀1-2h。
(5)离心(同上)，1000rpm，l0min。弃上清。
(6)加入二抗FITC/anti-human IgG(购自Jackson ImmunoResearch)或FITC/anti-His(购自Sigma)等重悬细胞(若没有荧光标记的相关二抗，则需先用一抗结合)。
(7)4℃旋转混匀30min-1h。
(8)4℃离心(BECKMAN COULTERTMMicrofuge22R Centrifuge)，1000rpm，10min。
(9)PBS重悬，用流式细胞仪(BECKMAN COULTERTMEPICS ELITE EST)进行检测。
实施例7 用流式细胞技术检测ACE2受体下调已知Vero E6细胞存在S蛋白的受体ACE2，检测S蛋白下调ACE2受体的作用，可用Vero E6细胞。
检测方法(1)将10cm细胞培养皿(Greiner bio-one)中生长至50％-70％满的Vero E6细胞的培养基(含有10％胎牛血清(Hyclone))去掉，用PBS洗三遍。
(2)加入无血清培养基在37℃的CO2培养箱(SANYO，MCO-15AC)中培养1小时。
(3)用PBS洗一遍，加入2mM EDTA/PBS，37℃的CO2培养箱中20-30min。
(4)将变圆的细胞吹打下来，均分为三份。
(5)1000rpm，10min离心(BECKMAN COULTERTM，Microfuge22RCentrifuge)，用800μl无血清培养基重悬，并加入适量EDTA。
(6)三份细胞中的一份加入对照用Fc，另外两份分别加入50μg的融合蛋白S1190-Fc。
(7)将对照Fc与其中一份加入了融合蛋白S1190-Fc的细胞置于4℃并缓慢旋转，将另一份置于37℃并缓慢旋转，此过程维持3小时。
(8)1000rpm，10min，4℃离心。
(9)PBS重悬后，1000rpm，10min，4℃离心。
(10)将FITC标记的抗Fc的抗体稀释到PBS中，并重悬细胞(在检测ACE2时，需先加抗ACE2的一抗，再加FITC标记的二抗)。
(11)4℃，缓慢旋转30min。
(12)1000rpm，10min，4℃离心。
PBS重悬后，用流式细胞仪(BECKMAN COULTERTMEPICS ELITE EST)进行检测。
实施例8细胞融合实验(1)用胰酶消化处于对数生长中期状态良好的的293ET细胞，待细胞变圆后，加入DMEM培养基(购自GIBCO)，吹打成单个细胞。
(2)计数2×105个细胞分到6孔细胞培养板的每个孔。
(3)24小时后，分别用脂质体(lipofectamineTM2000购自InvitrogenTM)转染所需质粒。
(4)24小时后，用胰酶将细胞消化下来，计数，将细胞两两混和，放入12孔细胞培养板一个孔。每孔每种细胞数分别为2×104，4×104，6×104，8×104，1×105。
(5)48-72小时后拍照(Nikon Eclipse TE2000-U)，可见明显的细胞融合，阴性对照未见融合。
实施例9证明蛋白S1190与ACE2受体相互作用的IP实验(1)用S1190-Fc和ACE2，对照Fc和ACE2两组质粒分别转染细胞。
(2)转染后36小时，将细胞置于冰上预冷，并用预冷的PBS洗3遍。
(3)加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，裂解20-30min。
(4)收集细胞及裂解液，12000rpm，2min，4℃离心(BECKMANCOULTERTM，Microfuge22R Centrifuge)。
(5)将上清移入新管，加入适量Protein G-Agarose，4℃缓慢旋转过夜。
(6)将上清与磁珠12000rpm，5min，4℃离心。
(7)去上清，加入适量裂解液重悬，并缓慢旋转20min。
(8)12000rpm，5min，4℃离心。
(9)去上清，加入与沉淀等体积的2×Western Blotting上样缓冲液，97℃，5min。
(10)快速离心，取上清，做Western Blotting检测。
实施例10蛋白提纯带有Fc标签的蛋白用Protein A的柱子提纯，带有6His标签的蛋白用镍柱提纯。
用Fc标记的蛋白采用Amersham公司的ProteinA蛋白柱进行纯化。(Amersham BiosciencesAB，Sweden；CATNO17-04020-03)(1)收集恒定表达细胞株培养的3天上清。
(2)透析收集的上清进行透析。透析液的成分为11.54mM/L的Na2HPO4，8.46mM/L的NaH2PO4(北京化工厂，中国)，1mM的EDTA(PromegaU.SA)，pH7.0。透析的时间一般不少于8小时，透析液的体积最少应为上清体积20倍。
(3)过滤透析完的液体进行过滤。采用的滤膜是Millipore公司生产的0.45μm的Durapore membrane filters(Millipore，Ireland；CAT NOHVLP04700)。
(4)纯化纯化的步骤按照Amersham公司提供的产品说明书上的protocol进行，采用的仪器是Bio-Rad公司生产的Econo Gradient Pump Kits(Bio-Rad U.S.A)。
(5)纯化完的蛋白样品经过Western Blotting和考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶染色来鉴定，蛋白浓度的测定用Lowry法(Lowry法试剂盒购自天象邦定公司，CATNOTB090-1)。
带有6His标签的蛋白提纯方法同上。
实施例11疫苗在血清中中和抗体的检测小鼠用S1190-Fc免疫后，体内产生中和抗体的滴度。
(1)将五周龄的雌性balb/c小鼠分为两组，每组5只。
(2)一组在0周、2周、4周注射50μg S1190-Fc加等量佛氏佐剂进行免疫，另一组注射同样剂量的Fc加同等剂量佛氏佐剂作为对照。
(3)第二，四，六周采血收集血清。
(4)将热灭活的血清进行双重稀释。
(5)用微量中和分析检测中和抗体的滴度。
在96孔板中梯度加入中和抗体，每个梯度加三个孔，然后每个孔加入SARS-CoV感染VeroE6单层贴壁细胞的TCID50剂量的100倍，第三天和第四天检测病毒致细胞病变影响(CPE)，用RM公式计算在50％的孔中能够完全抑制CPE的梯度，最后得到中和抗体的滴度。
实施例12肺弹性分析实验1)将2.5到3月龄的小鼠分为5组，每组5到7只。
2)用(ketamin)(75mg/kg)和甲苯噻嗪(xylazine)(20mg/kg)腹膜内注射，进行麻醉。
3)气管切开后用用可控制气流量的恒定流量通风机测定换气量。
4)利用气流量补充调整(VRM)(25cmH2O，3sec)标准化流量记录并作为基线测量。
5)进行酸或盐溶液处理前30分钟，分别在小鼠腹膜内注射S1190-Fc，S318-510-Fc，或对照Fc(每只5.5nmol/kg)。
6)用盐酸(pH＝1.5；2ml/kg)或盐水溶液进行气管内灌输后，然后测量气流量补充调整(VRM)(35cmH2O，3seconds)，将所有的实验动物通气3小时(F1O21.0)，并记录肺弹性分析。
7)全部PEEP(PEEPt)并且压力稳定(Pplat)后在呼气末和吸气梗塞时测量，asPplat minus PEEPt)/VT，在通气期间，每30分钟分别计算一次肺弹性。
8)酸或盐溶液处理后1小时和2小时，将小鼠再次分别腹膜内注射S1190-Fc，S318-510-Fc，或对照Fc(每只5.5nmol/kg)。
实施例13小鼠的免疫组化实验1)将如实施例12所述的小鼠右肺作为样本，用3.7％的福尔马林固定肺组织并用石蜡包埋。
2)切成5μm的组织切片。
3)用72℃的EDTA预处理。
4)用羊抗人Fc的夺克隆抗体(Jackson Immunological Research，Inc.)染色。用Vectastatin ABC试剂盒检测特异性着色部分。
实施例14H&E染色1)如实施例12中进行酸或盐处理并腹腔内注射S1190-Fc或对照Fc2)将小鼠右肺作为样本，用3.7％的福尔马林固定肺组织并用石蜡包埋。
3)切成5μm厚的组织切片。
4)用haematoxylin和eosin染色5)在显微镜下照像实施例15肺损伤评分在酸吸入后，用S1190-Fc和对照Fc处理的小鼠的肺损伤的半定量评估。
1)实施例14中每张切片随机选取4个视野，每组16个视野，根据规定的评分标准，用盲法评分。
2)评分范围包括肺泡充血，出血，中性粒细胞渗透，肺泡壁厚度，及透明膜形成等。
3)评分标准极低的损伤为0分，轻微损伤为1分，中度损伤为2分，严重损伤为3分，最高程度的损伤为4分。
序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白及其高量表达与纯化和用途<130>05-01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3741<212>DNA<213>人工序列<400>1ctagccagc gacctggacc gctgcaccac cttcgacgac gtgcaggccc ccaactacac 60ccagcacacc agcagcatgc gcggcgtgta ctaccccgac gagattttcc gcagcgacac120cctgtacctg acccaggacc tgttcctgcc cttctacagc aacgtgaccg gcttccacac180catcaaccac accttcggca accccgtgat ccccttcaag gacggcatct acttcgccgc240caccgagaag agcaacgtgg tccgcggctg ggtgttcggc agcaccatga acaacaagtc300ccagtccgtg atcatcatca acaacagcac caacgtggtg atccgcgcct gcaacttcga360gctgtgcgac aaccccttct tcgccgtgag caagcctatg gggacccaga cccacaccat420gatcttcgac aacgccttca actgcacctt cgagtacatc agcgacgcct tcagcctgga480cgtgagcgag aagagcggca acttcaagca cctgcgcgag ttcgtgttca agaacaagga540cggcttcctg tacgtgtaca agggctacca gcccatcgac gtggtgcgcg acctgcccag600cggcttcaac accctgaagc ccatcttcaa gctgcccctg ggcatcaaca tcaccaactt660ccgcgccatc ctgaccgcct tcagccccgc ccaggacatc tggggcacct ccgccgccgc720ctacttcgtg ggctacctga agcccaccac cttcatgctg aagtacgacg agaacggcac780catcaccgat gccgtcgact gcagccagaa ccccctggcc gagctgaagt gcagcgtgaa840gagcttcgag atcgacaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgcgtgg tgcccagcgg900cgacgtcgtg cgcttcccca acatcaccaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc960
caccaagttc cccagcgtgt acgcctggga gcgcaagaag atctccaact gcgtggccga1020ctacagcgtg ctgtacaaca gcaccttctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgagcgc1080caccaagctg aacgacctgt gcttcagcaa cgtgtacgcc gacagcttcg tcgtgaaggg1140cgacgacgtg cgccagatcg cccccggcca gaccggcgtg atcgccgact acaactacaa1200gctgcccgac gacttcatgg gctgcgtgct ggcctggaac acccgcaaca tcgacgccac1260cagcaccggc aactacaact acaagtaccg ctacctgcgc cacggcaagc tgcgcccctt1320cgagcgcgac atcagcaacg tgcccttcag ccccgacggc aagccctgca ccccccccgc1380cctgaactgc tactggcccc tgaacgacta cggcttctac accaccaccg gcatcggcta1440ccagccctac cgcgtggtgg tgctgagctt cgagctgctg aacgcccccg ccaccgtgtg1500cgggcccaag ctgagcaccg acctgatcaa gaaccagtgc gtgaacttca acttcaacgg1560cctgaccggc accggcgtcc tgacccccag cagcaagcgc ttccagccct tccagcagtt1620cgggcgcgac gtgagcgact tcaccgacag cgtgcgcgac cccaagacca gcgagatcct1680ggacatcagc ccctgcgcct tcggcggcgt gagcgtgatc acccccggca ccaacgccag1740cagcgaggtg gccgtgctgt accaggacgt gaactgcacc gacgtgagca ccgccatcca1800cgccgaccag ctgacccccg cctggcgcat ctacagcacc ggcaacaacg tgttccagac1860ccaggccggg tgcctgatcg gcgccgagca cgtggacacc agctacgagt gcgacatccc1920catcggggcc gggatctgcg ccagctacca caccgtgagc ctgctgcgca gcaccagcca1980gaagagcatc gtggcctaca ccatgagcct gggcgccgac agcagcatcg cctacagcaa2040caacaccatc gccatcccca ccaacttcag catcagcatc accaccgagg tgatgcccgt2100gagcatggcc aagaccagcg tggactgcaa tatgtacatc tgcggcgaca gcaccgagtg2160cgccaacctg ctgctgcagt acggcagctt ctgcacccag ctcaaccgcg ccctgagcgg2220catcgccgcc gagcaggacc gcaacacccg cgaggtgttc gcccaggtga agcagatgta2280caagaccccc accctgaagt acttcggcgg cttcaacttc agccagatcc tgcccgaccc2340cctgaagccc accaagcgca gcttcatcga ggacctgctg ttcaacaagg tgactctggc2400cgacgccggc ttcatgaagc agtacggcga gtgcctgggc gacatcaacg cccgcgacct2460gatctgcgcc cagaagttca acggcctgac cgtgctgccc cccctgctga ccgacgacat2520
gatcgccgcc tacaccgccg ccctggtgag cggtaccgcc accgccggct ggaccttcgg2580cgccggcgcc gccctgcaga tccccttcgc catgcagatg gcctaccgct tcaacggcat2640cggggtgacc cagaacgtgc tgtacgagaa ccagaagcag atcgccaacc agttcaacaa2700ggccatcagc cagatccagg agagcctgac caccaccagc accgccctgg gcaagctgca2760ggacgtggtc aaccagaacg cccaggccct gaacaccctg gtgaagcagc tcagcagcaa2820cttcggcgcc atcagcagcg tgctgaacga catcctgagc cgcctggaca aggtggaggc2880cgaggtgcag atcgaccgcc tgatcaccgg ccgcctgcag agcctgcaga cctacgtgac2940ccagcagctc atccgcgccg ccgagatccg cgccagcgcc aacctggccg ccaccaagat3000gagcgagtgc gtgctgggcc agagcaagcg cgtggacttc tgcggcaagg gctaccacct3060gatgagcttc ccccaggccg ccccccacgg cgtggtgttc ctgcacgtca cctacgtgcc3120cagccaggag cgcaacttca ccaccgcccc cgccatctgc cacgagggca aggcctactt3180cccccgcgag ggcgtgttcg tgttcaacgg gaccagctgg ttcatcaccc agcgcaactt3240cttcagcccc cagatcatca ccaccgacaa caccttcgtg agcggcaact gcgacgtggt3300gatcggcatc atcaacaaca ccgtgtacga ccccctgcag cccgagctgg acagcttcaa3360ggaggagctg gacaaatact tcaagaacca caccagcccc gacgtggacc tgggcgacat3420cagcggcatc aacgccagcg tggtgaacat ccagaaggag atcgaccgcc tgaacgaggt3480cgccaagaac ctgaacgaga gcctgatcga cctgcaggag ctgggcaagt acgagcagta3540catcaagtgg ccctggtacg tgtggctggg cttcatcgcc ggcctgatcg ccatcgtgat3600ggtgactatc ctgctgtgct gcatgacctc ctgctgctcc tgcctgaagg gcgcctgctc3660ctgcggctcc tgctgcaagt tcgacgagga cgacagcgag cccgtgctga agggcgtgaa3720gctgcactac accaaggatc c 374权利要求
1.一种SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白，其结构为X-Y-Z，其中X包括SARS-CoV病毒结构蛋白S或M或E或N，或以上结构蛋白的任意截短形式，所述SARS-CoV病毒结构蛋白S包括去除、修饰或者突变第318位氨基酸到510位氨基酸任意氨基酸片段，或者去除、修饰或突变第318位氨基酸到510位氨基酸片段；Y是连接部分，由0-20个任何氨基酸组成；Z是包含铰链区、CH2、CH3结构域的人IgG1的Fc及其变体或蛋白标签。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白，其特征在于所述蛋白标签包括且不限于六组氨酸(6XHis)标签、聚乙二醇(PEG)标签和人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)标签。
3.根据权利要求1所述的SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白，其特征在于所述SARS-CoV病毒结构蛋白S包括蛋白S的全长或其任意截短形式。
4.根据权利要求1所述的SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白，其特征在于所述SARS-CoV病毒结构蛋白S是不能与受体ACE2结合或者降低与ACE2结合能力的蛋白。
5.根据权利要求1所述的SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白，其特征在于所述的Y是两个氨基酸，所述的氨基酸为赖氨酸和精氨酸。
6.一种能够在哺乳动物细胞株中表达的SARS-CoV病毒S蛋白基因，其特征在于所述的基因为SEQ ID NO1。
7.含有SEQ ID NO1的重组表达质粒。
8.根据权利要求7所述的重组表达质粒，其特征在于所述的质粒包括真核PEAK系列。
9.哺乳动物细胞株，其含有如权利要求6所述的能够表达SARS-CoV病毒S蛋白基因的如权利要求1所述的SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的哺乳动物细胞株，其特征在于包括CHO、293和Vero细胞株及其衍生细胞株。
11.根据权利要求10所述的哺乳动物细胞株，其特征在于所述的细胞株是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的，保藏号分别为1408、1409、1410的细胞株。
12.如权利要求1所述的SARS-CoV病毒结构蛋白的融合蛋白的制备方法，包括(1)转染能够表达权利要求1所述融合蛋白及内源性二氢叶酸还原酶(endogenous dihydrofolate reductase)(dhfr)的重组表达质粒，构建哺乳动物细胞表达株；(2)该哺乳动物细胞表达株在正常生长状态下每24小时每百万细胞在其培养基中产生10μg以上重组蛋白；(3)纯化通过步骤(2)表达的蛋白。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的重组表达质粒含有的融合蛋白的引导序列，该序列是CD5蛋白的引导序列。
14.根据权利要求12所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的重组表达质粒，其结构蛋白的编码基因进行人工合成，用人体细胞内常用或者偏好密码子替换相同氨基酸的病毒基因中的密码子序列，对病毒的结构蛋白进行人类密码子优化。
15.根据权利要求12所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的表达SARS-CoV病毒的结构蛋白的融合蛋白，其用人体细胞常用或者偏好密码子合成的SARS-CoV的S蛋白基因如SEQ ID NO1所示。
16.根据权利要求12所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞表达株包括CHO、293和Vero细胞株及其衍生细胞株。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞表达株是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的，保减号分别为1408、1409、1410的细胞株。
18.根据权利要求12所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于构建哺乳动物细胞表达株所用的筛选药物包括嘌呤霉素和氨甲蝶呤。
19.根据权利要求12所述的融合蛋白的制备方法，其中所述的步骤(2)是每24小时每百万细胞在其培养基中可产生30μg或者以上的重组蛋白。
20.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的融合蛋白在制备预防SARS-CoV病毒的疫苗中的用途。
19.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的融合蛋白在制备SARS-CoV病毒检测试剂盒中的用途。
20.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的融合蛋白在制备或筛选抗SARS-CoV病毒感染的药物中的用途。
21.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的融合蛋白在制备防止SARS-CoV病毒感染的抗体中的用途。
22.一种去除、修饰或者突变表达SARS-CoV病毒结构蛋白S第318位氨基酸到510位氨基酸任意氨基酸片段，或者去除、修饰或突变表达SARS-CoV病毒结构蛋白S第318位氨基酸到510位氨基酸片段序列的DNA序列。
23.由权利要求22所述的DNA表达的氨基酸。
24.根据权利要求22或23所述的DNA序列或者所述的DNA表达的氨基酸在制备预防SARS-CoV病毒的疫苗中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，所述的疫苗包括DNA载体疫苗，蛋白疫苗，病毒载体疫苗。
全文摘要
本发明涉及SARS－CoV病毒结构蛋白的融合蛋白及其在哺乳动物细胞中的高量表达纯化和及其用途。该融合蛋白的结构表示为X－Y－z，其中X选自SARS－CoV病毒结构蛋白S或M或E或N，或它们的任意截短形式；Y是由0－20个氨基酸组成连接部分；Z是Fc及其变体或其它蛋白标签。本发明还提供了在哺乳动物细胞中高量表达和纯化此融合蛋白的方法，使其可进行批量制备或产业化生产。本发明所得的融合蛋白可制备预防SARS－CoV病毒感染的基因工程疫苗，SARS－CoV病毒检测试剂盒，及筛选可抑制S蛋白与其受体ACE2结合的抗SARS－CoV病毒感染的药物。本发明发现SARS－CoV病毒的S蛋白与ACE2的结合，引起ACE2表达下调，从而导致或加剧急性肺损伤，对S蛋白与ACE2结合的片段进行改造，可增加预防SARS－CoV病毒疫苗的安全 性。
文档编号G01N33/569GK1884303SQ200510082719
公开日2006年12月27日 申请日期2005年7月7日 优先权日2005年6月20日
发明者蒋澄宇, 郭峰, 饶栓, 关冰, 环奕, 杨鹏 申请人:中国医学科学院基础医学研究所