专利名称：严重急性呼吸道综合征SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的羧基端区域的表达纯化及非结构 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及对严重急性呼吸道综合征SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2进行基因工程改造以获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶的方法，以及严重急性呼吸道综合征SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2第113位到第638位氨基酸的三维晶体结构。
背景技术：
2002年底至2003年初，全球大规模爆发的SARS疫情引起了全人类的恐慌，极大挑战了我国和全世界应对重大疫情的能力，更引起了各国政府和科学家们对冠状病毒的极大重视。目前，尽管SARS疫情大规模爆发已经被控制住，2003年之后仍出现过小规模发作。虽然这些小规模的疫情很早被监视和控制在摇篮中，而没有形成再次大规模的爆发，但SARS疫情再次大规模爆发的可能性仍然存在。最近研究显示某些蝙蝠很有可能是SARS冠状病毒的天然宿主，而且SARS冠状病毒在适应性和生态压力的双重驱动下，会不断通过基因重排、重组和突变在其天然宿主中藏匿并伺机爆发，甚至会传播到新宿主身上，这说明冠状病毒对人类健康仍然是一个潜在威胁。因此，针对SARS冠状病毒的侵染、基因组复制和转录机制、与宿主相互作用关系、抑制剂药物开发以及疫苗的研发各方面的研究正在逐步深入地进行，以应对SARS疫情的再次爆发。解析SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的三维结构不仅对揭示其复制机制具有重要的科学意义，对开发抗SARS冠状病毒药物具有重要价值和理论指导意义。SARS冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，其基因组长度大约为30kb。SARS冠状病毒复制酶基因由两个大的开放阅读框ORFla和ORFlb组成，它们均位于基因组的5’端。ORFla编码一条长约441kDa的复制酶多蛋白ppla，ORFla和ORFlb共同编码一条长约741kDa的复制酶多蛋白pplab。pplab C端的ORFlb编码的复制酶部分在翻译时需要-1位的核糖体移位。这两个复制酶多蛋白被病毒编码的两个蛋白酶(一个木瓜蛋白酶类的半胱氨酸蛋白酶PLP2(nsp3)以及一个3C主蛋白酶(nsp5)共同切割成16个独立的功能亚基，这16个独立的功能亚基被称为非结构蛋白(Non-structrual protein, Nsp),在复制转录过程中形成复合物来共同行使功能。非结构蛋白nsp2是复制转录复合物的一个组成成分，已有的研究显示，nsp2似乎可以和包括nsp6, nsp7, nsp8, nspll, nspl5, nspl6在内的多种非结构蛋白相互作用，并存在一定的细胞内共定位，推测nsp2可能间接参与到病毒的转录与复制过程之中。也有研究表明，SARS冠状病毒nsp2可与宿主两个重要蛋白prohibitin I (PHBl)and prohibitin2(PHB2)及其形成的复合物相互作用，可能参与干扰宿主信号传递，降低宿主的免疫反应，从而利于SARS-CoV更好地复制和增殖，这些需要进一步的实验来确定。
而由于国内对严重急性呼吸道综合征SARS冠状病毒实验的严格限制和相关实验模型的缺乏，使得针对SARS冠状病毒活毒的实验无法进行。只能退而求其次，在细胞水平或者宿主动物模型上去研究与SARS冠状病毒属于同一种属的小鼠肝炎病毒MHV(mousehepatitis virus),或者SARS冠状病毒的假病毒或者复制子,但这些是不能替代SARS冠状病毒活毒的。对SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2蛋白质结构的解析对揭示蛋白质功能具有重大而直接的指导意义。
发明内容
本发明的一个方面，提供了一种将SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2进行基因工程改造，以提高其在大肠杆菌中能够得到高效表达的方法。本发明优选使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其他细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)，对以上所述蛋白以GST (谷胱甘肽-S-转移酶)融合蛋白的方式进行表达，并用于蛋白质结晶的方法。本发明述及在大肠杆菌中高效获得SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的表达方法。优选地，本发明将SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2进行了基因工程改造，将非结构蛋白nsp2全长基因进行了截短的研究，提供了一个可以在大肠杆菌中高效表达的方法，该方法包括了氨基端第110位氨基酸至C末端的编码基因，更优选地包括113位至638位氨基酸。根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种纯化SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的方法。将基因工程方法改造过以后的非结构蛋白nsp2基因连接于带有标签的表达性质粒载体中，转化进入大肠杆菌细胞中进行表达、纯化。优选地，其中所述的标签选自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、His-tag ;所述载体含有选择性标记基因。所述与特异标签识别的方法是通过亲和层析柱进行，所述去掉标签的方法通过用蛋白酶酶解，所述分离纯化蛋白的方法是进一步用离子交换层析等方法分离纯化非结构蛋白nsp2 ;用凝胶电泳的方法确定蛋白质的纯度；用分析型超速离心的方法确定蛋白质的聚合状态和均一性。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种结晶上述得到的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2蛋白的方法，所述的方法包括:将非结构蛋白nsp2浓缩至5-10mg/ml，在4-18摄氏度下用悬滴气相扩散法筛选晶体生长条件。根据本发明的另一个方面，本发明提供了衍射性能良好的非结构蛋白nsp2的蛋白质晶体。根据本发明的另一个方面，本发明提供了 SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的三维晶体结构，该结构描述了非结构蛋白nsp2的二级结构组成、肽链走向、组织模式以及三维分子构造。其中针对非结构蛋白nsp2晶体进行X射线晶体衍射，得到非结构蛋白nsp2晶体的晶体衍射数据，用所述的蛋白质晶体的衍射数据进一步通过结构解析，构建非结构蛋白nsp2的三维结构。其中所述非结构蛋白nsp2为所述非结构蛋白nsp2全长蛋白序列的从第113位氨基酸至638位氨基酸的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐标，或者SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体三维结构中至少40%氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表I中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。优选地，其中所述的母体晶体具有P6(5)空间群，晶胞参数为约:a = 112.8埃，b=112.8 埃，c = 91.1 埃，α = β = 90° , Y = 120。。优选地，其中所述非结构蛋白nsp2由α螺旋1，即含Met6_Vall2的氨基酸区段，α螺旋2，即含Prol8-Glu20的氨基酸区段，β折叠1，即含Leu26_Cys32的氨基酸区段，β折叠2,即含Asp36-Cys43的氨基酸区段，β折叠3,即含Ala48_Cys50的氨基酸区段，β折叠4，即含Gly54-Asn57的氨基酸区段，β折叠5，即含Val75_Pro78的氨基酸区段，α螺旋3，即含Pro80-Gln83的氨基酸区段，α螺旋4，即含Val93_Tyr96的氨基酸区段，β折叠6，即含Argll3-Phell5的氨基酸区段，β折叠7,即含Cysll8_Cysl25的氨基酸区段，β折叠8，即含Argl29-Alal36的氨基酸区段，α螺旋5，即含Glu 153_Aspl58的氨基酸区段，β折叠8，即含Asnl69_Ilel72的氨基酸区段，α螺旋6，即含Glul80_Phel89的氨基酸区段，α螺旋7，即含Thrl93-1le200的氨基酸区段，α螺旋8，即含Tyr205-Cys215的氨基酸区段，β折叠10，即含Lys219-Thr221的氨基酸区段，β折叠11，即含Trp230_Ile232的氨基酸区段，α螺旋9，即含Gln248-Ala258的氨基酸区段，α螺旋10，即含Ile268_Ile282的氨基酸区段，α螺旋11，即含Gln285-Thr296的氨基酸区段，α螺旋12，即含Val304_Thr311的氨基酸区段，α螺旋13，即含Val315_Leu325的氨基酸区段，α螺旋14，即含Arg334-Ala346的氨基酸区段，α螺旋15，即含Val348_Thr363的氨基酸区段，β折叠12，即含Phe366-Val369的氨基酸区段，β折叠13，即含Gln372_Val375的氨基酸区段，α螺旋16，即含Asp382-Met397的氨基酸区段，α螺旋17，即含Pro441_Ala444的氨基酸区段。其中，由所述的β折叠I与2，3与4各自相互反平行，然后一起组成一个类似于β折叠桶的形状；β折叠5，8，7，6组成一个反平 行β片层的扭曲的平面；β折叠9，10，11，组成一个平行的β片层；β折叠12，13组成一个反平行β片层。所述的非结构蛋2的中间区域富含α螺旋，三个为一组，交错盘旋，C末端则多为无规卷曲。优选地，其中所述非结构蛋白nsp2中结合有两个选自锌、镁、锰、铜、钴、铁构成的组中的金属离子，其中两个金属离子分别位于由Cys32-Cys35-Cys50_Cys53、Cys79-CyS82-HiS91-CyS125构成的四元锚定中心。更优选地，其中所述金属离子为锌离子。优选地，其中所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2包含两个锌指结构域，分别可以代表为CX2CX14CX2C、CX2CX8HX3C。更优选地，SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2所含有的第一个锌指结构域类似于转录因子的锌指，第二个锌指则是全新的折叠类型。两个锌指对于SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2功能的发挥具有决定性的作用。优选地，其中所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构整体为全新的折叠类型，锌指结构域的发现为其功能的发掘与阐释提供了理论指导依据，也为设计和筛选可能的抑制剂奠定了理论基础。根据本发明的另一个方面，本发明提供了上述SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体三维结构在其功能研究、设计和筛选可能的抑制剂方面的应用，包括:根据蛋白质的三维结构，通过计算机模拟来寻找可能的特定的活性位点或者结合口袋；根据蛋白质的三维结构，通过找到的可能的特定的活性位点或者结合口袋，找寻可能的底物类型，进行生化实验，并将可能的特定的活性位点或者结合口袋中的氨基酸突变，验证突变的效果；将根据蛋白质的三维结构，结合上述实验结果，进行体内天然底物类型的发掘，并将之扩展到与所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2序列相似性在至少30%的其他病毒种属，进而分析和总结。根据本发明的另一个方面，提供了基于SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2蛋白质三维结构，探索其功能的方法，包括:通过蛋白结晶方法获得SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体，或者获得SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2蛋白质晶体的三维结构坐标，其中所述三维结构包括任何与该坐标中至少含有40%氨基酸残基的主链碳骨架原子三维坐标的平均根方差小于等于1.5埃的结构；进行生化实验分析验证基于结构的预测理论。
图1为基于来自四种不同病毒类型的非结构蛋白nsp2的序列对比。其中，包括来源于四种不同冠状病毒代表毒株的非结构蛋白nsp2，即人冠状病毒HCoV-229E、SARS冠状病毒 SARS-CoV-BJOl、小鼠肝炎病毒MHV-A59 (Mouse Heptitis Virus)和鸟支气管炎病毒 IBV-M41 (Avian Infectious Bronchitis Virus)。其非结构蛋白 nsp2的编码序列分别为:HCoV-229E来自美国国立卫生院数据库Accession:NP_073550.1，SARS-CoV-BJOI来自美国国立卫生院数据库Accession:NP_828850.1，MHV-A59来自美国国立卫生院数据库Accession:NP _045298.1，IBV-M41来自美国国立卫生院数据库Accession:NP—040829.1。这一比对结果表明，来源于冠状病毒属三个种群的非结构蛋白nsp2的一级序列保守性不高，SARS-CoV的非结构蛋白nsp2与同属同一种群的MHV的非结构蛋白nsp2才具有相对较高的一级序列相似性。图中用...表示在相对应区段的氨基酸缺失，红色和黄色表示保守型高低。在说明书及权利要求书中具体的氨基酸位置均是以SARS-CoV的非结构蛋白nsp2的序列说明的。图2为SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的纯化和电泳图。⑷为SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2经过阴离子交换层析的情况。(B)为SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2经过阴离子交换层析后的蛋白质电泳图，显示目的蛋白(58kD处)的纯度在90%以上。图3为SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的母体蛋白质晶体图。(A)为进行优化之前的晶体图片。(B)为进行优化之后的晶体图片。图4为SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的母体蛋白质晶体衍射图。其中左下角的小图为分辨率最外壳层的衍射点。图5为SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的三维结构图。其中，该结构按照两个不同锌指以及不同的结构域而使用了不同的色彩，其中，锌原子用橙色球状模型表示，依次标记为ZN1，ZN2。锌指I区域用红色表示，锌指2区域用蓝色，螺旋富集区用彩色表示，C端无规卷曲区用红色表示，连接不同结构域之间的区域用灰色表示。
具体实施例方式本发明人提供了一种将SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2进行基因工程改造，以提高其在大肠杆菌中能够得到高效表达蛋白的方法。通过X射线衍射晶体学方法解析了 SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的分辨率达2.7埃的三维晶体结构。
SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2蛋白的表达纯化方法:来源于SARS冠状病毒cDNA的非结构蛋白nsp2的基因，其编码的蛋白质序列为:SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2蛋白质序列MAVTRYVDNNFCGPDGYPLDCIKDFLARAGKSMCTLSEQLDYIESKRGVYCCRDHEHEIAWFTERSDKSYEHQTPFEIKSAKKFDTFKGECPKFVFPLNSKVKVIQPRVEKKKTEGFMGRIRSVYPVASPQECNNMHLSTLMKCNHCDEVSWQTCDFLKATCEHCGTENLVIEGPTTCGYLPTNAVVKMPCPACQDPEIGPEHSVADYHNHSNIETRLRKGGRTRCFGGCVFAYVGCYNKRAYWVPRASADIGSGHTGITCDNVETLNEDLLEILSRERVNINIVGDFHLNEEVAIILASFSASTSAFIDTIKSLDYKSFKTIVESCGNYKVTKGKPVKGAWNIGQQRSVLTPLCGFPSQAAGVIRSIFARTLDAANHSIPDLQRAAVTILDGISEQSLRLVDAMVYTSDLLTNSVIIMAYVTGGLVQQTSQWLSNLLGTTVEKLRPIFEWIEAKLSAGVEFLKDAWEILKFLITGVFDIVKGQIQVASDNIKDCVKCFIDVVNKALEMCIDQVTIAGAKLRSLNLGEVFIAQSKGLYRQCIRGKEQLQLLMPLKAPKEVTFLE⑶SHDTVLTSEEVVLKNGELEALETPVDSFTNGAIVGTPVCVNGLMLLEIKDKEQYCALSPGLLATNNVFRLKGG即
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权利要求
1.一种严重急性呼吸道综合征SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构，其中，所述SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2为所述SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2全长蛋白序列的从第I位氨基酸至约280位氨基酸的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐标，或者β -内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构中至少40%氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表I中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
2.根据权利要求1所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构，其中，所述SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2为所述SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2全长蛋白序列的从113位氨基酸至638位氨基酸的编码基因，这里重新编号为1-526，以下所用编号均依据于此。
3.根据权利要求1所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构，其中所述的母体晶体具有P6 (5)空间群，晶胞参数为约:a = 112.8埃，b = 112.8埃，c = 91.1埃，α =β = 90°，Y = 120。。
4.根据权利要求1或2所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构，其中所述SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2所述非结构蛋白nsp2由α螺旋1，即含Met6_Vall2的氨基酸区段，α螺旋2，即含Prol8-Glu20的氨基酸区段，β折叠1，即含Leu26-Cys32的氨基酸区段，β折叠2,即含Asp36-Cys43的氨基酸区段，β折叠3,即含Ala48_Cys50的氨基酸区段，β折叠4，即含Gly54-Asn57的氨基酸区段，β折叠5，即含Val75_Pro78的氨基酸区段，α螺旋3，即含Pro80-Gln83的氨基酸区段，α螺旋4，即含Val93_Tyr96的氨基酸区段，β折叠6,即含Argll3-Phell5的氨基酸区段，β折叠7,即含Cysll8_Cysl25的氨基酸区段，β折叠8，即含Argl29-Alal36的氨基酸区段，α螺旋5，即含Glu 153_Aspl58的氨基酸区段，β折叠8，即含Asnl69-1lel72的氨基酸区段，α螺旋6，即含Glul80_Phel89的氨基酸区段，α螺旋7，即含Thrl93-1le200的氨基酸区段，α螺旋8，即含Tyr205-Cys215的氨基酸区段，β折叠10，即含Lys219-Thr221的氨基酸区段，β折叠11，即含Trp230-1le232的氨基酸区段，α螺旋9，即含Gln248_Ala258的氨基酸区段，α螺旋10，即含Ile268-1le282的氨基酸区段，α螺旋11，即含Gln285_Thr296的氨基酸区段，α螺旋12，即含Val304-Thr311的氨基酸区段，α螺旋13，即含Val315_Leu325的氨基酸区段，α螺旋14，即含Arg334-Ala346的氨基酸区段，α螺旋15，即含Val348_Thr363的氨基酸区段，β折叠12，即含Phe366-Val369的氨基酸区段，β折叠13，即含Gln372_Val375的氨基酸区段，α螺旋16，即含Asp382_Met397的氨基酸区段，α螺旋17，即含Pro441_Ala444的氨基酸区段。其中，由所述的β折叠I与2，3与4各自相互反平行，然后一起组成一个类似于β折叠桶的形状；β折叠5，8，7，6组成一个反平行β片层的扭曲的平面；β折叠9，10，11，组成一个平行的β片层；β折叠12，13组成一个反平行β片层。所述的非结构蛋2的中间区域富含α螺旋，三个为一组，交错盘旋，C末端则多为无规卷曲。
5.根据权利要求1或2所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构，其中所述SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2中结合有三个选自锌、镁、锰、铜、钴、铁构成的组中的金属离子，其中两个金属离子分别位于由Cys32-Cys35-Cys50_Cys53、Cys79-CyS82-HiS91-CyS125构成的四元锚定中心。更优选地，其中所述金属离子为锌离子。
6.根据权利要求4所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构，其中所述金属离子为锌离子。
7.根据权利要求4或5所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构，其中所述金属SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2包含两个锌指结构域，分别可以代表为CX2CX14CX2C、CX2CX8HX3C。更优选地，SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2所含有的第一个锌指结构域类似于转录因子的锌指，第二个锌指则是全新的折叠类型。两个锌指对于SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2功能的发挥具有决定性的作用。
8.根据权利要求1-6所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构，其中所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2整体为全新的折叠类型，锌指结构域的发现为其功能的发掘与阐释提供了理论指导依据，也为设计和筛选可能的抑制剂奠定了理论基础。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体三维结构在其功能研究、设计和筛选可能的抑制剂方面的应用，包括: 根据蛋白质的三维结构，通过计算机模拟来寻找可能的特定的活性位点或者结合口袋； 根据蛋白质的三维结构，通过找到的可能的特定的活性位点或者结合口袋，找寻可能的底物类型，进行生化实验，并将可能的特定的活性位点或者结合口袋中的氨基酸突变，验证突变的效果； 将根据蛋白质的三维结构，结合上述实验结果，进行体内天然底物类型的发掘，并将之扩展到与所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2序列相似性在至少30%的其他病毒种属，进而分析和总结。
10.一种纯化SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的方法，其中，将权利要求1所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2基因连接于带有标签的表达性质粒载体中，转化进入大肠杆菌细胞中进行表达、纯化 。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述的标签选自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、His-tag、特异性抗体,所述载体含有选择性标记基因。
12.—种结晶前述权利要求中任一项所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2蛋白的方法，所述的方法包括:将SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2浓缩至5-10mg/ml，在4_30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件。
13.一种衍射性能良好的根据前述权利要求中任一项所述的SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2蛋白质晶体。
全文摘要
本发明提供一种严重急性呼吸道综合征SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的羧基端区域的晶体三维结构，其中SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的氨基端区域为所述SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的从约110～约150位氨基酸至在约600至638位范围内的氨基酸，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的氨基端的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。本发明还提供对SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的表达、纯化和结晶的方法；以及SARS冠状病毒非结构蛋白nsp2的晶体结构及晶体结构在功能研究、潜在药物筛选及药物设计方面的理论指导意义和应用。
文档编号C07K14/165GK103172712SQ201110429198
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者饶子和, 李元元, 杨诚, 刘祥, 王权, 董辉, 李慧娟, 王中玲, 陈卫强 申请人:天津市国际生物医药联合研究院