专利名称：具有低免疫副作用的神经生长因子突变体的制备方法及其药物应用价值的制作方法
技术领域：
:本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及鼠源神经生长因子(mNGF)与脂类小分子IysoPS复合物的晶体结构以及复合物的细胞生物学效应。具体地，本发明通过晶体结构分析确定了 mNGF结合IysoPS的关键氨基酸，即第88位赖氨酸，随后利用定点突变技术突变该位点，制备突变体蛋白并开展细胞实验。研究结果表明，mNGF突变体蛋白结合IysoPS的能力明显下降，其对细胞的毒副作用也明显降低。本发明提供上述复合物的晶体结构，脂类小分子IysoPS的结构特点，mNGF突变体蛋白的制备方法以及其在调控免疫系统和神经系统药物方面的用途。
背景技术：
:神经生长因子(NGF)在人体中广泛分布，是一个有着复杂功能的生物活性蛋白。学者们对NGF的研究遍及NGF提取纯化、基因定位、家族成员、膜受体，到它的转运、膜内信号传导和调控机制，还有NGF的三·维结构以及与受体复合物的三维结构。成熟的有生物活性的NGF以同源二聚体的形式存在于生物体中，其单体是含有120个氨基酸的多肽，分子量约为13kD。两个单体的折叠片以广泛的疏水作用形成稳定非共价的活性双体形式。NGF具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能，对种属和周围神经元的生长、发育、分化、正常状态的维持、凋亡、损伤后的保护和轴突的有效再生都有着重要作用。研究表明，NGF在神经系统以外表现出非常活跃的生物学功能，主要表现在影响免疫细胞的活性，进而调节免疫系统功能，在免疫系统炎症疾病中扮演了非常重要的角色。但是NGF在免疫系统微环境中的作用到目前研究得还不是很透彻，还有很多问题有待解决。NGF是一个功能多样的生物活性分子，它与不同的受体识别传递不同的信号，引导细胞回馈不同的反应，它与不同细胞上的同种受体识别后也会产生不同的效应。NGF通过两种受体不仅调控细胞内相关蛋白激酶和效应蛋白的活性和分布，诱导细胞做出各种抉择，还可以诱导细胞膜上和细胞内脂类分子的合成和降解，调控它们的分布，激活脂分子下游的效应蛋白，发挥复杂的功能。胞内的这些蛋白和脂分子在NGF的调控下协同作用或相互制约。在这些研究中经常可以注意到一些脂类分子的存在，这些脂类分子或是与其受体偶联的信号通路相关，或是与调节NGF的受体表达水平相关，或是被NGF调节等等。长久以来，科学家们都是在NGF周边间接地研究这些脂分子与NGF相关的生物功能，也很少有学者直接的将NGF与脂分子联系起来。例如，从蛇毒和大鼠颌下腺中提取的NGF与IysoPS可以共同诱导肥大细胞的脱颗粒反应，释放出多种炎症介质:如5-羟色胺(5-HT)、组胺(hiatamine)和白介素等,而二者单独作用并不能诱发此效应，但是其机理至今仍然不清
/E.0脂类是一类低溶于水却易溶于非极性溶剂的生物有机分子。脂类是富含能量的营养素，是生物体中能量的一种储存形式，脂类也是组成生物膜的重要组分，为保持膜的完整性和流动性提供支持。脂类还作为一些物质的前体形式存在。近年来研究表明脂类也参与了细胞信号传导，有一些非常重要的脂类被定义为第二信使，发挥传递信号的中介功能，调控生命活动。来自鼠的NGF近几年已经作为国家一类新药上市，是有效的治疗神经系统疾病的新型生物制剂，适用于神经内科、神经外科和创伤等病症。但是由于NGF生物功能的多样性，其作为药物应用的同时可能会带来潜在的副作用，其分子生物学机制还在不断深入研究中。表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)技术是目前国际上广泛用于研究两种分子相互作用的手段。这种方法检测生物分子的相互作用时，无需对生物分子进行标记，只需将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子的溶液流过芯片表面，就可以检测两种分子的结合、解离全过程。这种方法适用于多种生物体系，包括小分子化合物、多肽、蛋白质、寡 核苷酸、寡聚糖、病毒、细胞等等。实验中使用的传感器芯片是GE公司生产的CM5芯片，传感片CM5表面覆盖了一层葡聚糖。带有化学基团如-NH2，-SH, -CHO, -OH, -COOH的生物分子可通过化学反应，以共价键耦联的方式与葡聚糖上的羧基耦联，从而使生物分子不可逆的耦联到传感片表面。我们的目的蛋白鼠源NGF是天然提取的，没有任何标签，所以我们选了 CM5传感片
发明内容
:本发明利用结构生物学方法解析了蛇毒神经生长因子cNGF的晶体结构，第一次在NGF双体的疏水通道中发现了脂类分子的存在。由一级序列比对及三级结构的保守性分析，我们推测其它来源的神经生长因子也具有结合脂类分子的能力。根据cNGF中发现的脂类小分子的结构特点，我们选取了多种具有类似结构特征的脂类小分子，利用SPR技术研究了它们与鼠源神经生长因子mNGF之间的相互作用，得到了 mNGF结合脂类分子的结构特点。能够与mNGF形成较高亲和力复合物的脂类小分子其结构特征为:具有一个极性头部，如磷酸基团或糖基修饰，结构式中有一条或两条由40个左右碳原子组成的疏水碳链，具有一定的可溶性。随后利用结构生物学方法解析了鼠源神经生长因子mNGF与脂类小分子IysoPS复合物的晶体结构。通过mNGF与IysoPS复合物晶体结构分析，我们找到了 mNGF结合IysoPS分子头部磷酸基团的关键氨基酸，即，第88位赖氨酸，利用定点突变技术突变该位点并制备突变体蛋白，随后开展细胞实验。研究结果表明mNGF与特定的脂类小分子形成的高亲和力复合物具有不同于mNGF本身的重要的细胞生物学功能，具体表现在mNGF与IysoPS共同刺激小鼠肥大细胞瘤细胞可以诱导其释放组胺。mNGF双体中的某些关键氨基酸对于脂类分子的结合进而对复合物功能的发挥具有非常重要的作用。我们有理由推测mNGF与脂类分子的结合可能是mNGF作为药物应用时产生副作用的潜在因素。通过SPR实验证明突变体蛋白结合脂类分子的能力明显下降，而其刺激小鼠肥大细胞瘤细胞时组胺释放水平也明显下降。因此mNGF突变体蛋白可以作为一种具有低免疫副作用的NGF药物替代品。在本发明中提供下列:1.鼠源神经生长因子mNGF与脂类小分子IysoPS复合物的晶体结构，其中每两个mNGF组成一个双体分子，每个双体分子中夹有一个IysoPS分子。
2.鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO:2，将其称为K88L mNGF,即将mNGF的第88位氨基酸由带电荷的赖氨酸突变为不带电荷的侧链长度相近的中性氨基酸亮氨酸。3.第2项的鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白用于制备低免疫副作用的神经生长因子替代药物的应用。4.一种低免疫副作用的神经生长因子替代药物，其包含治疗有效量的第2项所述的鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白。附图简述:
图1是mNGF及其突变体K88L mNGF与IysoPS复合物的小鼠肥大细胞瘤细胞组胺释放实验。相比mNGF，突变体K88L mNGF所引起的组胺释放效应明显降低。图2是mNGF与IysoPS复合物的晶体结构。在双体结合面的疏水通道中夹着一个IysoPS 分子。
图3是鼠源神经生长因子mNGF的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。图4是鼠源神经生长因子第88位突变体蛋白K88LmNGF的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。本领域技术人员应该理解，实施例中所用的试剂除特别说明外均为市售分析纯级别的试剂。实施例11、SPR实验分析鼠源神经生长因子(mNGF)与多种脂类小分子的亲和力本实施例所用的脂类小分子购买白avanti polar lipids, Inc。使用GE公司的Biocore 3000仪器进行SPR实验分析。当光线从高折射率的介质进入低折射率的介质时，一部分光线会在接触面上被反射。当入射角大于临界角的时候，光线会发生全反射。但是，当玻璃的表面覆盖一层薄的惰性金属膜(如金)时，金属膜表面的等离子体(plasma)发生振动，一部分光会“损失”在金属膜上。当入射光的波矢量与表面等离子体振子的频率一致的时候，电子发生“共振”，这种现象被称为表面等离子共振(surface plasmon resonance)。当反射光的强度达到最小值时的入射角,被称为表面等离子共振角(9 spr, surface plasmon resonance angle) APR随金属膜表面介质的折射率变化而变化，而折射率的变化则与结合在金属表面的分子质量成正比。因此，我们可以通过观察表面等离子共振角，来分析生物分子之间的相互作用。结果描绘为RU (resonance unit)对时间的图。实验流程:首先选取合适的PH值将目的蛋白固定到CM5芯片表面，一般是PH4.5到5.5之间的醋酸钠溶液，NGF在酸性溶液中表现稳定，选取PH5.5的醋酸钠溶液按标准化流程固定目标蛋白(即，mNGF)，用流动相溶液50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5将小分子分别稀释到终浓度为10ug/ml-300ug/ml之间，通过芯片。以30ul/min的流速注射,持续注射时间为lmin,并记录相应曲线。使用BIAcore3000白行携带软件BIAevaluation 4.1版进行数据分析。
在BIAcore实验中，我们测试了 13种小分子(如表I所示)与mNGF的结合能力。在这部分实验中，我们只是定性的分析了小分子能否与mNGF结合，并没有测试他们之间的亲和力。结果显示有3种小分子与11^^有相互作用，分别是？4、？1 2、1780 3，它们的分子式和结构式见表I。表I选取的脂类分子名称和结构信息表
权利要求
1.鼠源神经生长因子mNGF与脂类小分子IysoPS复合物的晶体结构，其中每两个mNGF组成一个双体分子，每个双体分子中夹有一个IysoPS分子。
2.鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:2，其中第88位氨基酸由K突变为L，将其称为K88L mNGF。
3.权利要求2的鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白用于制备低免疫副作用的神经生长因子替代药物的应用。
4.一种低免疫副作用的神经生长因子替代药物，其包含治疗有效量的权利要求2所述的鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及鼠源神经生长因子(mNGF)与脂类小分子lysoPS复合物的晶体结构以及复合物的细胞生物学效应。通过晶体结构分析确定了mNGF结合lysoPS的关键氨基酸，即，第88位赖氨酸，随后利用定点突变技术突变该位点，制备突变体蛋白并开展细胞实验。研究结果表明，mNGF突变体蛋白结合lysoPS的能力明显下降，其对细胞的毒副作用也明显降低。本发明提供上述复合物的晶体结构，脂类小分子lysoPS的结构特点，mNGF突变体蛋白的制备方法以及其在调控免疫系统和神经系统药物方面的用途。
文档编号C07K14/48GK103159843SQ201110427988
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者江涛, 唐捷, 童琼, 周洪哲, 孙含丽 申请人:中国科学院生物物理研究所