生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用。本发明所提供的细菌是将特异质粒导入出发菌得到的，所述特异质粒是在出发质粒中导入PqqA蛋白的编码基因、PqqB蛋白的编码基因、PqqC蛋白的编码基因、pqqD蛋白的编码基因和PqqE蛋白的编码基因得到的。所述PqqA蛋白为(Y1)或(Y2)或(Y3)：(Y1)PqqA1蛋白、PqqA2蛋白和PqqA3蛋白；(Y2)PqqA1蛋白、PqqA2蛋白和PqqA3蛋白中的任意两个蛋白；(Y3)PqqA1蛋白、PqqA2蛋白或PqqA3蛋白。实验证明，本发明所提供的细菌可有效提高PQQ的产量，具有原料低廉、工艺简单、生产效率高等优点，具有良好的工业化应用前景。CGMCC No.1062020150313
【专利说明】
生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及微生物领域，具体涉及生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 吡略喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一种广泛存在于革兰氏阴性菌 中，在人和动、植物体内也有微量存在的氧化还原酶辅酶。PQQ参与呼吸链的电子传递，具有 促进机体生长和神经生长因子合成、调节机体自由基水平等生理功能，在食品和医药保健 领域具有重要的开发前景。迄今为止，仅有部分革兰氏阴性细菌能够产生PQQ，但大肠杆菌 (Escherichia coli.)不能合成PQQ。不同细菌的PQQ合成量差距显著，例如假单胞菌属、微 环菌属和枝动杆菌属的细菌只能合成微量的PQQ以满足自身的生理代谢需求，而生丝微菌 属、交替单胞菌属和嗜甲基菌属等甲基营养菌能产生过量PQQ并分泌至胞外。
[0003] 脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)属于生丝微菌属，是一类可以甲 醇等一碳化合物为唯一碳源和能源来源的化能异养兼性厌氧菌。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何生产吡咯喹啉醌。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种特异DNA分子。
[0006] 本发明所提供的特异DNA分子，可包括如下元件：区段A、区段B、区段C、区段D和区 段E;
[0007] 所述区段A可为如下（1)或(2)或(3):
[0008] (1)含有PqqAl蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因和PqqA3蛋白的编码基因的 DNA分子；
[0009] (2)含有PqqAl蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因和PqqA3蛋白的编码基因中 的任意两个编码基因的DNA分子(如含有PqqAl蛋白的编码基因和PqqA2蛋白的编码基因的 DNA分子）；
[0010] (3)含有PqqAl蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因或PqqA3蛋白的编码基因的 DNA分子；
[0011] 所述区段B可为含有PqqB蛋白的编码基因的DNA分子；
[0012]所述区段C可为含有PqqC蛋白的编码基因的DNA分子；
[0013]所述区段D可为含有PqqD蛋白的编码基因的DNA分子；
[0014]所述区段E可为含有PqqE蛋白的编码基因的DNA分子。
[0015] 所述PqqAl蛋白可为al)或a2):
[0016] al)氣基酸序列是序列表中序列1所不的蛋白质；
[0017] a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0018] 所述PqqA2蛋白可为bl)或b2):
[0019] bl)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
[0020] b2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0021] 所述PqqA3蛋白可为cl)或c2):
[0022] cl)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
[0023] c2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0024] 所述PqqB蛋白可为dl)或d2):
[0025] dl)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
[0026] d2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0027] 所述PqqC蛋白可为el)或e2):
[0028] el)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；
[0029] e2)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0030] 所述PqqD蛋白可为fl)或f2):
[0031] Π )氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；
[0032] f2)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0033]所述PqqE蛋白可为gl)或g2):
[0034] gl)氨基酸序列是序列表中序列7所示的蛋白质；
[0035] g2)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0036] 所述PqqAl蛋白的编码基因可为A1)或A2)或A3):
[0037] A1)核苷酸序列是序列表中序列9所示的DNA分子；
[0038] A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqAl蛋白 的DNA分子；
[0039] A3)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqAl蛋白的 DNA分子。
[0040] 所述PqqA2蛋白的编码基因可为B1)或B2)或B3):
[0041] B1)核苷酸序列是序列表中序列10所示的DNA分子；
[0042] B2)与B1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqA2蛋白 的DNA分子；
[0043] B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA2蛋白的 DNA分子。
[0044] 所述PqqA3蛋白的编码基因可为C1)或C2)或C3):
[0045] C1)核苷酸序列是序列表中序列11所示的DNA分子；
[0046] C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqA3蛋白 的DNA分子；
[0047] C3)在严格条件下与Cl)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA3蛋白的 DNA分子。
[0048] 所述PqqB蛋白的编码基因可为D1)或D2)或D3):
[0049] D1)核苷酸序列是序列表中序列13所示的DNA分子；
[0050] D2)与D1)限定的核苷酸序列具有75 %或75 %以上同一性，且编码所述PqqB蛋白的 DNA分子；
[0051] D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqB蛋白的DNA 分子。
[0052] 所述PqqC蛋白的编码基因可为E1)或E2)或E3):
[0053] E1)核苷酸序列是序列表中序列14所示的DNA分子；
[0054] E2)与E1)限定的核苷酸序列具有75 %或75 %以上同一性，且编码所述PqqC蛋白的 DNA分子；
[0055] E3)在严格条件下与E1)或E2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqC蛋白的DNA 分子。
[0056] 所述PqqD蛋白的编码基因可为F1)或F2)或F3):
[0057] F1)核苷酸序列是序列表中序列15所示的DNA分子；
[0058] F2)与F1)限定的核苷酸序列具有75 %或75 %以上同一性，且编码所述PqqD蛋白的 DNA分子；
[0059] F3)在严格条件下与F1)或F2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqD蛋白的DNA 分子。
[0060] 所述PqqE蛋白的编码基因可为G1)或G2)或G3):
[0061] G1)核苷酸序列是序列表中序列16所示的DNA分子；
[0062] G2)与G1)限定的核苷酸序列具有75 %或75 %以上同一性，且编码所述PqqE蛋白的 DNA分子；
[0063] G3)在严格条件下与G1)或G2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqE蛋白的DNA 分子。
[0064]上述任一所述的特异DNA分子，依次可包括如下元件:所述区段A、所述区段B、所述 区段C、所述区段D和所述区段E。
[0065] 所述特异DNA分子可为（zl)或（z2)或（z3)或（z4)或（z5)或（z6)或（z7)或（z8)或 (z9)或(zlO):
[0066] (zl)含有序列表的序列9所示DNA序列和序列表的序列12所示DNA序列的DNA分子；
[0067] (z2)含有序列表的序列9所示DNA序列和序列表的序列12自5'末端起第12至3222 位所不DNA序列的DNA分子；
[0068] (z3)含有序列表的序列10所示DNA序列和序列表的序列12所示DNA序列的DNA分 子；
[0069] (z4)含有序列表的序列10所示DNA序列和序列表的序列12自5'末端起第12至3222 位所不DNA序列的DNA分子；
[0070] (Z5)含有序列表的序列11所示DNA序列和序列表的序列12所示DNA序列的DNA分 子；
[0071] (Z6)含有序列表的序列11所示DNA序列和序列表的序列12自5'末端起第12至3222 位所不DNA序列的DNA分子；
[0072] (z7)含有序列表的序列9所示DNA序列、序列表的序列18所示DNA序列和序列表的 序列12所不DNA序列的DNA分子；
[0073] (z8)含有序列表的序列9所示DNA序列、序列表的序列18所示DNA序列和序列表的 序列12自5 '末端起第12至3222位所示DNA序列的DNA分子；
[0074] (z9)含有序列表的序列9所示DNA序列、序列表的序列18所示DNA序列、序列表的序 列19所不DNA序列和序列表的序列12所不DNA序列的DNA分子；
[0075] (zlO)含有序列表的序列9所示DNA序列、序列表的序列18所示DNA序列、序列表的 序列19所示DNA序列和序列表的序列12自5 '末端起第12至3222位所示DNA序列的DNA分子。
[0076 ]含有上述任一所述特异DNA分子的特异质粒也属于本发明的保护范围。
[0077]所述特异质粒的制备方法可如下:在出发质粒中导入所述区段A、所述区段B、所述 区段C、所述区段D和所述区段E，得到重组质粒。
[0078]所述特异质粒的制备方法具体可如下:在出发质粒中导入所述区段A、所述PqqB蛋 白的编码基因、所述PqqC蛋白的编码基因、所述PqqD蛋白的编码基因和所述的PqqE蛋白的 编码基因，得到重组质粒。所述出发质粒可为常规的表达载体。所述出发质粒具体可为质粒 pBAD/hisB。所述质粒pBAD/hisB为invitrogen公司产品，产品目录号为V430-01。
[0079]所述特异质粒的制备方法中，各个编码基因可以分别插入所述出发质粒的不同酶 切位点，也可以以任一组合形式分别插入所述出发质粒的不同酶切位点。
[0080] 所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdAlBE。所述重组质粒pBHdAlBE为向质粒 pBAD/h i sB的限制性内切酶Nco I和Nhe I的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分 子，限制性内切酶EcoRI和Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到 的。所述重组质粒pBHdAlBE表达所述PqqAl蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋 白和所述PqqE蛋白。
[0081 ] 所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdA2ffi。所述重组质粒pBHdA2ffi为向质粒 pBAD/h i sB的限制性内切酶Nco I和Nhe I的识别位点之间插入序列表的序列10所示的DNA分 子，限制性内切酶EcoRI和Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到 的。所述重组质粒pBHdA2BE表达所述PqqA2蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋 白和所述PqqE蛋白。
[0082] 所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdA3ffi。所述重组质粒pBHdA3ffi为向质粒 pBAD/h i sB的限制性内切酶Nco I和Nhe I的识别位点之间插入序列表的序列11所示的DNA分 子，限制性内切酶EcoRI和Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到 的。所述重组质粒pBHdA3BE表达所述PqqA3蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋 白和所述PqqE蛋白。
[0083] 所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdAlA2BE。所述重组质粒pBHdAlA2BE为向质粒 pBAD/h i sB的限制性内切酶Nco I和Nhe I的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分 子，限制性内切酶Nhel和PstI的识别位点之间插入序列表的序列18所示的DNA分子，限制性 内切酶EcoRI和Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到的。所述重 组质粒pBHdAlA2BE表达所述PqqAl蛋白、所述PqqA2蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所 述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白。
[0084] 所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdAlA2A3BE。所述重组质粒pBHdAlA2A3BE为向 质粒pBAD/h i sB的限制性内切酶Nco I和Nhe I的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA 分子，限制性内切酶Nhel和PstI的识别位点之间插入序列表的序列18所示的DNA分子，用限 制性内切酶PstI和EcoRI的识别位点之间插入序列表的序列19所示的DNA分子，限制性内切 酶EcoRI和Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到的。所述重组质 粒pBHdAlA2A3BE表达所述PqqAl蛋白、所述PqqA2蛋白、所述PqqA3蛋白、所述PqqB蛋白、所述 PqqC蛋白、所述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白。
[0085] 含有上述任一所述特异质粒的重组菌也属于本发明的保护范围。
[0086] 所述重组菌的制备方法可如下：将上述任一所述特异质粒导入出发菌，得到重组 菌。
[0087] 上述重组菌的制备方法中，所述出发菌可为大肠杆菌。
[0088] 上述重组菌的制备方法中，所述出发菌可为大肠杆菌突变株。所述大肠杆菌突变 株是通过将大肠杆菌基因组中iscR蛋白的编码基因沉默得到的。所述大肠杆菌突变株具体 可为大肠杆菌K12 Δ iscR，大肠杆菌K12 Δ iscR为日本国立遗传学研究所的产品，产品编号 为ECK2528。
[0089] 所述iscR蛋白可为hi)或h2):
[0090] hi)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；
[0091] h2)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0092] 所述iscR蛋白的编码基因可为H1)或H2)或H3):
[0093] H1)核苷酸序列是序列表中序列17所示的DNA分子；
[0094] H2)与H1)限定的核苷酸序列具有75 %或75 %以上同一性，且编码所述iscR蛋白的 DNA分子；
[0095] H3)在严格条件下与HI)或H2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述iscR蛋白的DNA 分子。
[0096] 上述重组菌的制备方法中，所述出发菌可为大肠杆菌K12。
[0097] 上述任一所述特异DNA分子，或，上述任一所述特异质粒，或，上述任一所述重组菌 在制备吡咯喹啉醌中的应用也属于本发明的保护范围。
[0098] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备吡咯喹啉醌的方法。
[0099] 本发明所提供的制备吡咯喹啉醌的方法，可包括如下步骤:发酵培养上述任一所 述重组菌，得到吡咯喹啉醌。
[0100] 上述方法中，所述发酵培养使用的培养基可为发酵培养基甲或发酵培养基乙。
[0101] 所述发酵培养基甲为含0.4~0.6g/L L-阿拉伯糖的M9培养基。
[0102] 所述发酵培养基乙为含0.4~0.6g/L L-阿拉伯糖和25~35μΜ二价铁离子的M9培 养基。
[0103] 所述发酵培养基乙中，所述二价铁离子是以硫酸亚铁的形式加入的。
[0104] 所述发酵培养中，初始接种量为2 %~7 %。
[0105] 所述发酵培养的培养条件为35°C~39°C、培养60~70h。
[0106]下述A)或B)也属于本发明的保护范围：
[0107] A)融合蛋白，包括如下元件：PqqA蛋白、上述任一所述PqqB蛋白、上述任一所述 PqqC蛋白、上述任一所述PqqD蛋白和上述任一所述PqqE蛋白；
[0108] 所述PqqA蛋白为如下(P1)或(P2)或(P3):
[0109] (P1)上述任一所述PqqAl蛋白、上述任一所述PqqA2蛋白和上述任一所述PqqA3蛋 白；
[0110] (P2)上述任一所述PqqAl蛋白、上述任一所述PqqA2蛋白和上述任一所述PqqA3蛋 白中的任意两个蛋白（如上述任一所述PqqAl蛋白和上述任一所述PqqA2蛋白）；
[0111] (P3)上述任一所述PqqAl蛋白、上述任一所述PqqA2蛋白或上述任一所述PqqA3蛋 白；
[0112] B)蛋白组合物，由所述PqqA蛋白、上述任一所述PqqB蛋白、上述任一所述PqqC蛋 白、上述任一所述PqqD蛋白、上述任一所述PqqE蛋白组成。
[0113]实验证明，在出发质粒中导入本发明提供的特异DNA分子，得到重组质粒，然后将 该重组质粒导入大肠杆菌K12AisCR，得到重组菌。利用该重组菌可有效提高PQQ的产量，具 有原料低廉、工艺简单、生产效率高等优点，具有良好的工业化应用前景。
【附图说明】
[0114] 图1为PQQ测定标准曲线。
[0115] 图2为实施例3步骤一的PQQ产量的检测结果。
[0116] 图3为实施例3步骤二的PQQ产量的检测结果。
【具体实施方式】
[0117] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0118] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0119] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0120] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0121] 大肠杆菌K12记载在如下文献中：Tomoya Baba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa， Yuki Takai，Yoshiko Okumura，Miki Baba，KirillA Datsenko，Masaru Tomita，Barry L Wanner and Hirotada Mori 1. Construction of Escherichia coli K_12in-frame， single-gene knockout mutants：the Keio collection.Molecular Systems Biology.2006:1-11).公众可以从福建师范大学(即
【申请人】处)获得，以重复本申请实验。
[0122] 大肠杆菌K12AiscR为日本国立遗传学研究所的产品，产品编号为ECK2528。大肠 杆菌K12Ai scR是通过将大肠杆菌K12基因组中编码iscR蛋白的基因敲除得到的。所述iscR 蛋白氣基酸序列如序列表中序列8所不。所述编码iscR蛋白的基因为如序列表中序列17所 不。
[0123] 质粒pBAD/hisB为invitrogen公司产品，产品目录号为V430-01 JQQ标准品为 Sigma公司产品，产品目录号为D7783JNA Assembly试剂盒、T4连接酶、限制性内切酶Ncol、 限制性内切酶NheI、限制性内切酶PstI、限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶Hindm均为 NEB公司产品，产品目录号分别为E2621、M0202、R3193、R3131、R3140、R310GPR3104。
[0124] M9培养基的溶质及其浓度为:磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵lg/L、氯 化钠0 · 5g/L、甘油2 · 5g/L、葡萄糖0 · 5g/L、硫酸镁0 · 12g/L、氯化钙33mg/L、微量元素液lmL/ L，溶剂为蒸馏水，pH值为7.0;其中微量元素液的溶质及其浓度为：氯化铁8.3g/L、氯化锌 0.84g/L、氯化锰0.016g/L、氯化铜0.13g/L、氯化钴0.1g/L、硼酸0.1g/L、生物素 lg/L和维生 素也lg/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然。
[0125] M9培养基甲：含L-阿拉伯糖的M9培养基，L-阿拉伯糖在M9培养基甲中的浓度为 0.5g/L〇
[0126] M9培养基乙：含L-阿拉伯糖和FeS〇4的M9培养基，L-阿拉伯糖在M9培养基乙中的浓 度为0.5g/L，FeS〇4在M9培养基乙中的浓度为30μΜ。
[0127] LB固体培养基:将胰蛋白胨10g、酵母浸提物5g、NaCl 5g和琼脂粉15g溶于1L蒸馏 水得到的。
[0128] LB固体平板:将LB固体培养基趁热倒入培养皿中，得到LB固体平板。
[0129] 脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificans)FJNU_R8CGMCC No. 10620于2015 年3月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，公众可从中国普通微生物菌种保 藏管理中心获得该菌株。脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU_R8CGMCC No. 10620在下文中简称脱氮生丝微菌。
[0130]实施例1、构建重组大肠杆菌
[0131] -、构建重组质粒
[0132] 1、重组质粒pBHdAlBE的构建
[0133] (1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。
[0134] (2)人工合成引物FI: 5 ' -CATGCCATGGAAAGCAGTTACCG-3 '（下划线为限制性内切酶 Ncol的酶切识别序列）和R1:5 ' -CTAGCTAGCTCAGATGAGGTTGATCTCAG-3 '（下划线为限制性内 切酶Nhel的酶切识别序列）。
[0135] (3)完成步骤（1)和(2)后，以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F1和R1为引物进 行PCR扩增，得到约140bp的双链DNA分子。
[0136] (4)用限制性内切酶Nco I和Nhe I双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产 物。
[0137] (5)用限制性内切酶Ncol和Nhel双酶切质粒pBAD/hisB，回收约4. lkb的载体骨架。
[0138] (6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到 中间质粒。
[0139] (7)人工合成引物F2:
[0140] S'-CTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTC ^AG(jAGATA.TA^T(jA.ICATAAAA(tT6CTCGGGT ATGATCATAAAAGTGCTCGGGT-3 '（下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双 下划线为序列表中序列12自5'末端起第12至33位）和R2:5'_ CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTCTAGTTATCCGATGTAGCCT-：r (下创钱为席^nRAD/ii i sR h 的 同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至3222位的反向互补序列）。
[0141 ] (8)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到约 3.3kb的双链DNA分子。
[0142] (9)用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切步骤(6)得到的中间质粒，回收约4.2kb 的载体骨架。
[0143] (10)将步骤⑶得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly 试剂盒连接，得到重组质粒pBHdAlBE。
[0144] 根据测序结果，对重组质粒pBHdAlBE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限制 性内切酶Nco I和Nhe I的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切酶 EcoRI和Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdAlBE表 达序列表中序列1所不的蛋白质（以下简称PqqAl蛋白）、序列表中序列4所不的蛋白质（以下 简称PqqB蛋白）、序列表中序列5所不的蛋白质（以下简称PqqC蛋白）、序列表中序列6所不的 蛋白质（以下简称PqqD蛋白）和序列表中序列7所不的蛋白质（以下简称PqqE蛋白）。
[0145] 2、重组质粒pBHdA2BE的构建
[0146] (1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。
[0147] (2)人工合成引物F3:5 ' -CATGCCATGGAGGACATCATGAAGAC-3 '（下划线为限制性内切 酶NcoI的酶切识别序列）和R3:5 ' -CTAGCTAGCTTAGATGAGGTCGATCTCGG-3 '（下划线为限制性 内切酶Nhel的酶切识别序列）。
[0148] (3)完成步骤（1)和(2)后，以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F3和R3为引物进 行PCR扩增，得到约11 Obp的双链DNA分子。
[0149] (4)用限制性内切酶Nco I和Nhe I双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产 物。
[0150] (5)用限制性内切酶Ncol和Nhel双酶切质粒pBAD/hisB，回收约4. lkb的载体骨架。 [0151 ] (6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到 中间质粒。
[0152] (7)人工合成引物F2:
[0153] 5 ' -CTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTC^AGGAGATATAk]'GATCM'AAAAGTGCTCGGGT-3 '（下 划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末 端起第 12至33位）和R2:5，-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTCTAGTTATCCGATGTAGCCT-h，（下 划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至 3222位的反向互补序列）。
[0154] (8)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到约 3.3kb的双链DNA分子。
[0155] (9)用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切步骤(6)得到的中间质粒，回收约4.2kb 的载体骨架。
[0156] (10)将步骤⑶得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly 试剂盒连接，得到重组质粒pBHdA2BE。
[0157] 根据测序结果，对重组质粒pBHdA2BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限制 性内切酶Nco I和Nhe I的识别位点之间插入序列表的序列10所示的DNA分子，限制性内切酶 EcoRI和Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdA2BE表 达序列表中序列2所不的蛋白质（以下简称PqqA2蛋白）、序列表中序列4所不的PqqB蛋白、序 列表中序列5所不的PqqC蛋白、序列表中序列6所不的PqqD蛋白和序列表中序列7所不的 PqqE蛋白。
[0158] 3、重组质粒pBHdA3BE的构建
[0159] (1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。
[0160] (2)人工合成引物 F4:5 ' -CATGCCATGGGTATGAAAGTCTGGACGAAACC-3 '（下划线为限制 性内切酶NcoI的酶切识别序列）和R4:5 '-CTAGCTAGCTTAGATCAGATCGATCTCAGCC-3 '（下划线 为限制性内切酶Nhel的酶切识别序列）。
[0161] (3)完成步骤（1)和(2)后，以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F4和R4为引物进 行PCR扩增，得到约11 Obp的双链DNA分子。
[0162] (4)用限制性内切酶Nco I和Nhe I双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产 物。
[0163] (5)用限制性内切酶Ncol和Nhel双酶切质粒pBAD/hisB，回收约4. lkb的载体骨架。
[0164] (6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到 中间质粒。
[0165] (7)人工合成引物F2:
[0166] 5' -CTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTC^AGGAGATATAkTGATCATAMAGTGCT：CGGGT-3'(下 划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末 端起第 12至33位)和R2:5 '-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAArTCTTCTAGTTATCCGATGTAGCCT-3 '（下 划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至 3222位的反向互补序列）。
[0167] (8)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到约 3.3kb的双链DNA分子。
[0168] (9)用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切步骤(6)得到的中间质粒，回收约4.2kb 的载体骨架。
[0169] (10)将步骤⑶得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly 试剂盒连接，得到重组质粒pBHdA3BE。
[0170] 根据测序结果，对重组质粒pBHdA3BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限制 性内切酶Ncol和Nhel的识别位点之间插入序列表的序列11所示的DNA分子，限制性内切酶 EcoRI和Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdA3BE表 达序列表中序列3所不的蛋白质（以下简称PqqA3蛋白）、序列表中序列4所不的PqqB蛋白、序 列表中序列5所不的PqqC蛋白、序列表中序列6所不的PqqD蛋白和序列表中序列7所不的 PqqE蛋白。
[0171] 4、重组质粒pBHdAlA2BE的构建
[0172] (1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。
[0173] (2)人工合成引物F5:5 '-CTAGCTAGCAAGGAGATATAATGGAGGACATCATGAAGAC-3 '（下划 线为限制性内切酶Nhel的酶切识别序列）和R5:5 ' -AACTGCAGTTAGATGAGGTCGATCTCGG-3 '（下 划线为限制性内切酶PstI的酶切识别序列）。
[0174] (3)完成步骤（1)和⑵后，以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F5和R5为引物进 行PCR扩增，得到约130bp的双链DNA分子。
[0175] (4)用限制性内切酶Nhe I和Pst I双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产 物。
[0176] (5)用限制性内切酶NheI和PstI双酶切步骤1中（6)得到的中间质粒，回收约4. lkb 的载体骨架。
[0177] (6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到 中间质粒甲。
[0178] (7)人工合成引物F2:
[0179] 5' -CTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTC^AGGAGATATA^T6ATCATAAAAGTGCTCGGGT-3'(下 划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末 端起第 12至33位）和R2:5，-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTCTAGTTATCCGATGTAGCCT-3，（下 划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至 3222位的反向互补序列）。
[0180] (8)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到约 3.3kb的双链DNA分子。
[0181 ] (9)用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切步骤（6)得到的中间质粒甲，回收约 4.2kb的载体骨架。
[0182] (10)将步骤⑶得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly 试剂盒连接，得到重组质粒pBHdAl A2BE。
[0183] 根据测序结果，对重组质粒pBHdAlA2BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限 制性内切酶Nco I和Nhe I的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切酶 Nhe I和Pst I的识别位点之间插入序列表的序列18所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRI和 Hindm的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdAlA2BE表达序 列表中序列1所不的PqqAl蛋白、序列表中序列2所不的PqqA2蛋白、序列表中序列4所不的 PqqB蛋白、序列表中序列5所不的PqqC蛋白、序列表中序列6所不的PqqD蛋白和序列表中序 列7所示的PqqE蛋白。
[0184] 5、重组质粒pBHdAlA2A3BE的构建
[0185] (1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。
[0186] (2)人工合成引物 F6:5，-AACTGCAGAAGGAGATATAATGAAAGTCTGGACGAAACC (下划线为 限制性内切酶PstI的酶切识别序列）-3 '和R6:5 '-GGAATTCTTAGATCAGATCGATCTCAGCC(下划 线为限制性内切酶EcoRI的酶切识别序列)-3 '。
[0187] (3)完成步骤（1)和(2)后，以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F6和R6为引物进 行PCR扩增，得到约120bp的双链DNA分子。
[0188] (4)用限制性内切酶Pst I和EcoRI双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产 物。
[0189] (5)用限制性内切酶PstI和EcoRI双酶切步骤4中（6)得到的中间质粒甲，回收约 4.2kb的载体骨架。
[0190] (6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到 中间质粒乙。
[0191] (7)人工合成引物F7:
[0192] 5' -ccgagatcgacctcatctaagaattcKaggagatata^tgatcataaaagtgctcgggt-3 '(下 划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末 端起第 12至33位）和R2:5，-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTCTAGTTATCCGATGTAGCCT-3，（下 划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至 3222位的反向互补序列）。
[0193] (8)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以F7和R2为引物进行PCR扩增，得到约 3.3kb的双链DNA分子。
[0194] (9)用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切步骤（6)得到的中间质粒乙，回收约 4.3kb的载体骨架。
[0195] (10)将步骤⑶得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly 试剂盒连接，得到重组质粒pBHdAl A2A3BE。
[0196] 根据测序结果，对重组质粒pBHdAlA2A3BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的 限制性内切酶Ncol和Nhel的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切 酶Nhel和PstI的识别位点之间插入序列表的序列18所示的DNA分子，用限制性内切酶PstI 和EcoRI的识别位点之间插入序列表的序列19所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRI和Hind ΙΠ 的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdA 1A2A3BE表达序列 表中序列1所不的PqqAl蛋白、序列表中序列2所不的PqqA2蛋白、序列表中序列3所不的 PqqA3蛋白、序列表中序列4所不的PqqB蛋白、序列表中序列5所不的PqqC蛋白、序列表中序 列6所不的PqqD蛋白和序列表中序列7所不的PqqE蛋白。
[0197] 二、构建重组大肠杆菌
[0198] 1、构建重组大肠杆菌KQ01
[0199] 将重组质粒pBHdAlBE导入大肠杆菌K12,得到含重组质粒pBHdAlffi的大肠杆菌 K12,命名为重组大肠杆菌KQ01，简称KQ01。
[0200] 2、构建重组大肠杆菌KQ02
[0201] 将重组质粒pBHdAlBE导入大肠杆菌Κ12Δ iscR，得到含重组质粒pBHdAlBE的大肠 杆菌K12 Δ iscR，命名为重组大肠杆菌KQ02，简称KQ02。
[0202] 3、构建重组大肠杆菌KQ03
[0203] 将重组质粒pBHdA2BE导入大肠杆菌K12 Δ iscR，得到含重组质粒pBHdA2BE的大肠 杆菌K12 Δ iscR，命名为重组大肠杆菌KQ03，简称KQ03。
[0204] 4、构建重组大肠杆菌KQ04
[0205] 将重组质粒pBHdA3BE导入大肠杆菌K12 Δ iscR，得到含重组质粒pBHdA3BE的大肠 杆菌K12 Δ iscR，命名为重组大肠杆菌KQ04,简称KQ04。
[0206] 5、构建重组大肠杆菌KQ05
[0207] 将重组质粒pBHdAlA2BE导入大肠杆菌K12 Δ iscR，得到含重组质粒pBHdAlA2BE的 大肠杆菌K12 Δ iscR，命名为重组大肠杆菌KQ05，简称KQ05。
[0208] 6、构建重组大肠杆菌KQ06
[0209] 将重组质粒pBHdAlA2A3BE导入大肠杆菌K12 Δ iscR，得到含重组质粒 pBHdAlA2A3BE的大肠杆菌K12 Δ iscR，命名为重组大肠杆菌KQ06,简称KQ06。
[0210] 7、构建重组大肠杆菌KQ07 (空载体对照）
[0211] 将质粒pBAD/hisB导入大肠杆菌K12AiscR，得到含质粒pBAD/hisB的大肠杆菌K12 Δ iscR，命名为重组大肠杆菌KQ07,简称KQ07。
[0212]实施例2、单位细胞PQQ产量的测定
[0213] 采用高效液相色谱(HPLC)测定单位细胞PQQ产量，具体测定步骤如下：
[0214] -、PQQ标准曲线的绘制
[0215] 取lmg PQQ标准品，置于25mL容量瓶，加入20mL超纯水，涡旋使其完全溶解后再用 超纯水定容至25mL，得到PQQ标准品浓度为40mg/L的溶液1;然后用超纯水将溶液1稀释，依 次得到PQQ标准品浓度为30mg/L的溶液2、PQQ标准品浓度为20mg/L的溶液3、PQQ标准品浓度 为16mg/L的溶液4、PQQ标准品浓度为12mg/L的溶液5、PQQ标准品浓度为8m g//L的溶液6、PQQ 标准品浓度为6mg/L的溶液7、PQQ标准品浓度为4mg//L的溶液8和PQQ标准品浓度为2mg//L的 溶液9。将上述各溶液用0.22μπι的水系滤头过滤，收集滤液，然后采用HPLC进行定量测定，以 吸收峰(保留时间为1.78~1.79min)的峰面积为横坐标，溶液浓度为纵坐标，绘制PQQ标准 曲线，见图1。
[0216] HPLC 测定条件如下：色谱柱:WatersXBridge?Cls 反相柱（3·5μηι，150Χ2· 1mm);柱 温:45<€;检测波长:330]1111;流动相：（水+0.15/^?4):乙腈(>:￥)=20:80;流速:0.2511117 /111；[11。
[0217] 二、单位细胞PQQ产量的测定方法 [0218] 1、待测菌液中的PQQ产量的测定
[0219] 取5mL待测菌液，10000g离心5min，得到上清。取所述上清，用0.22μπι的水系滤头过 滤，收集滤液并采用HPLC进行定量测定。根据待测菌液吸收峰的峰面积和步骤一绘制的PQQ 标准曲线，得到待测菌液中的PQQ产量。
[0220]待测菌液中的PQQ产量的计算公式如下：
[0221 ]待测菌液中的 PQQ 产量(CpQQ，mg/L) = 1 · 3746 X Pst+0 · 8096;
[0222] 其中Pst代表待测菌液吸收峰的峰面积(Pst单位:μν · S)。
[0223] 2、待测菌液中生物量的测定
[0224] 取20mL待测菌液，置于已称重的离心管中，10000g离心5min，弃上清，然后将含有 菌体的离心管置于烘箱中，80°C处理48h，然后称重(m 2)。
[0225] 待测菌液中生物量的计算公式如下：
[0226] 待测菌液中生物量(DCW，g/L) = .02;
[0227] 其中m2代表含有菌体的离心管重量(单位代表空离心管的重量(单位:g)。
[0228] 3、单位细胞PQQ产量的计算
[0229] 单位细胞PQQ产量的计算公式如下：
[0230] 单位细胞PQQ产量(PPQQ，mg/g DCW)=Cpqq/DCW。
[0231] 实施例3、利用实施例1构建的KQ01~KQ06生产PQQ
[0232] -、添加二价铁离子对单位细胞PQQ产量的影响
[0233] 1、在含100yg/mL氨卞青霉素的LB固体平板上活化实施例1构建的KQ01 (活化条件 为:37°C，12h)，得到KQ01单克隆。
[0234] 2、完成步骤1后，取KQ01单克隆，接种至10mL含100yg/mL氨卞青霉素的M9培养基 中，37 °C、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。
[0235] 3、完成步骤2后，取培养菌液1，以1:20的体积比接种至M9培养基甲或M9培养基乙， 30 °C、200rpm振荡培养65h，得到培养菌液2。
[0236] 4、按照实施例2的方法，测定培养菌液2中单位细胞PQQ产量和生物量，得到KQ01接 种至M9培养基甲或M9培养基乙中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0237] 按照上述方法，将KQ01替换为KQ02，其它步骤均不变，得到KQ02接种至M9培养基甲 或M9培养基乙中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0238] 实验结果见图2(KQ01为KQ01接种至M9培养基甲；KQ01+30ym Fe为KQ01接种至M9培 养基乙；KQ02为KQ02接种至M9培养基甲；KQ02+30ym Fe为KQ02接种至M9培养基乙）。结果表 明，KQ01在M9培养基乙中的单位细胞PQQ产量更高，可见，在培养基中添加二价铁离子有利 于大肠杆菌K12的合成PQQ，单位细胞PQQ产量从2.42mg/g DCW提高到3.07mg/g DCW;KQ02在 M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量为3.13mg/g DCW，在M9培养基乙中的单位细胞PQQ产量为 3.19mg/g DCW，两者无显著差异，表明培养大肠杆菌K12AiscR的培养基中无论是否含有二 价铁离子，均可促进PQQ的合成。上述各生物量均无显著差异。
[0239] 二、PqqAl蛋白、PqqA2蛋白或PqqA3蛋白对单位细胞PQQ产量的影响
[0240] 1、在含100yg/mL氨卞青霉素的LB固体平板上活化实施例1构建的KQ02(活化条件 为:37°C，12h)，得到KQ02单克隆。
[0241] 2、完成步骤1后，取KQ02单克隆，接种至含100yg/mL氨卞青霉素的M9培养基中，37 °C、200rpm振荡培养24h，得到培养菌液1。
[0242] 3、完成步骤2后，取培养菌液1，以5% (体积百分比）的接种量接种至119培养基甲， 30 °C、200rpm振荡培养65h，得到培养菌液2。
[0243] 4、按照实施例2的方法，测定培养菌液2中单位细胞PQQ产量和生物量，得到KQ02接 种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0244]按照上述方法，将KQ02替换为KQ03，其它步骤均不变，得到KQ03接种至M9培养基甲 中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0245] 按照上述方法，将KQ02替换为KQ04，其它步骤均不变，得到KQ04接种至M9培养基甲 中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0246] 按照上述方法，将KQ02替换为大肠杆菌K12 Δ iscR，其它步骤均不变，得到大肠杆 菌K12 △ iscR接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量(作为对照）。
[0247] 按照上述方法，将KQ02替换为KQ07，其它步骤均不变，得到KQ07接种至M9培养基甲 中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0248] 实验结果见图3中A。结果表明，KQ02、KQ03和KQ04在M9培养基甲中的单位细胞PQQ 产量分别为3.22mg/g DCW、2.12mg/g DCW和3.56mg/g DCW;大肠杆菌K12AiscR和KQ07在M9 培养基甲中的单位细胞PQQ产量均为〇mg/g DCW。大肠杆菌K12 Δ 4(^、即07、明02、1^03和 KQ04在M9培养基甲中的生物量无显著差异。上述结果表明，序列表中序列11所示的pqqA3基 因最有利于单位细胞PQQ产量的提高。
[0249] 三、蛋白种类对单位细胞PQQ产量的影响
[0250] 1、在含100yg/mL氨卞青霉素的LB固体平板上活化实施例1构建的KQ02(活化条件 为:37°C，12h)，得到KQ02单克隆。
[0251] 2、完成步骤1后，取KQ02单克隆，接种至含100yg/mL氨卞青霉素的M9培养基中，37 °C、200rpm振荡培养24h，得到培养菌液1。
[0252] 3、完成步骤2后，取培养菌液1，以5% (体积百分比）的接种量接种至119培养基甲， 30 °C、200rpm振荡培养65h，得到培养菌液2。
[0253] 4、按照实施例2的方法，测定培养菌液2中单位细胞PQQ产量和生物量，得到KQ02接 种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0254]按照上述方法，将KQ02替换为KQ05，其它步骤均不变，得到KQ05接种至M9培养基甲 中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0255] 按照上述方法，将KQ02替换为KQ06，其它步骤均不变，得到KQ06接种至M9培养基甲 中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0256] 按照上述方法，将KQ02替换为大肠杆菌K12 Δ iscR，其它步骤均不变，得到大肠杆 菌K12 △ iscR接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量(作为对照）。
[0257] 按照上述方法，将KQ02替换为KQ07，其它步骤均不变，得到KQ07接种至M9培养基甲 中的单位细胞PQQ产量和生物量。
[0258] 实验结果见图3中B。结果表明，KQ02、KQ05和KQ06在M9培养基甲中的单位细胞PQQ 产量分别为3.10mg/g DCW、3.48mg/g DCW和4.18mg/g DCW;大肠杆菌K12AiscR和KQ07在M9 培养基甲中的单位细胞PQQ产量均为〇mg/g DCW。大肠杆菌K12 Δ 4(^、即07、明02、1^05和 KQ06在M9培养基甲中的生物量无显著差异。上述结果表明，在大肠杆菌K12 Δ iscR中表达 PqqAl蛋白、PqqA2蛋白和PqqA3蛋白的种类越多，其单位细胞PQQ产量就越高。
【主权项】
1.特异DNA分子，包括如下元件：区段A、区段B、区段C、区段D和区段E; 所述区段A为如下（1)或(2)或(3): (1) 含有PqqAl蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因和PqqA3蛋白的编码基因的DNA 分子； (2) 含有PqqAl蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因和PqqA3蛋白的编码基因中的任 意两个编码基因的DNA分子； (3) 含有PqqAl蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因或PqqA3蛋白的编码基因的DNA 分子； 所述区段B为含有PqqB蛋白的编码基因的DNA分子； 所述区段C为含有PqqC蛋白的编码基因的DNA分子； 所述区段D为含有PqqD蛋白的编码基因的DNA分子； 所述区段E为含有PqqE蛋白的编码基因的DNA分子； 所述PqqAl蛋白为al)或a2): al)氣基酸序列是序列表中序列1所不的蛋白质； a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质； 所述PqqA2蛋白为bl)或b2): bl)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质； b2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质； 所述PqqA3蛋白为cl)或c2): cl)氣基酸序列是序列表中序列3所不的蛋白质； c2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质； 所述PqqB蛋白为dl)或d2): dl)氣基酸序列是序列表中序列4所不的蛋白质； d2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质； 所述PqqC蛋白为el)或e2): el)氣基酸序列是序列表中序列5所不的蛋白质； e2)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质； 所述PqqD蛋白为Π )或f 2): f 1)氣基酸序列是序列表中序列6所不的蛋白质； f2)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质； 所述PqqE蛋白为gl)或g2): gl)氣基酸序列是序列表中序列7所不的蛋白质； g2)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。2.如权利要求1所述的特异DNA分子，其特征在于： 所述PqqA 1蛋白的编码基因为A1)或A2)或A3): A1)核苷酸序列是序列表中序列9所示的DNA分子； A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqAl蛋白的DNA 分子； A3)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqAl蛋白的DNA分 子； 所述PqqA2蛋白的编码基因为B1)或B2)或B3): B1)核苷酸序列是序列表中序列10所示的DNA分子； B2)与B1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqA2蛋白的DNA 分子； B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA2蛋白的DNA分 子； 所述PqqA3蛋白的编码基因为C1)或C2)或C3): C1)核苷酸序列是序列表中序列11所示的DNA分子； C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqA3蛋白的DNA 分子； C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA3蛋白的DNA分 子； 所述PqqB蛋白的编码基因为D1)或D2)或D3): D1)核苷酸序列是序列表中序列13所示的DNA分子； D2)与D1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqB蛋白的DNA 分子； D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqB蛋白的DNA分 子； 所述PqqC蛋白的编码基因为E1)或E2)或E3): E1)核苷酸序列是序列表中序列14所示的DNA分子； E2)与E1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqC蛋白的DNA 分子； E3)在严格条件下与E1)或E2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqC蛋白的DNA分 子； 所述PqqD蛋白的编码基因为F1)或F2)或F3): F1)核苷酸序列是序列表中序列15所示的DNA分子； F2)与F1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqD蛋白的DNA 分子； F3)在严格条件下与F1)或F2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqD蛋白的DNA分 子； 所述PqqE蛋白的编码基因为G1)或G2)或G3): G1)核苷酸序列是序列表中序列16所示的DNA分子； G2)与G1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述PqqE蛋白的DNA 分子； G3)在严格条件下与G1)或G2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqE蛋白的DNA分 子。3. 含有权利要求1或2所述特异DNA分子的特异质粒。4. 如权利要求3所述的特异质粒，其特征在于:所述特异质粒的制备方法如下：在出发 质粒中导入权利要求1或2中所述区段A、所述区段B、所述区段C、所述区段D和所述区段E，得 到的重组质粒。5. 含有权利要求3或4所述特异质粒的重组菌。6. 如权利要求5所述的重组菌，其特征在于:所述重组菌的制备方法如下：将所述特异 质粒导入出发菌，得到重组菌。7. 如权利要求6所述的重组菌，其特征在于:所述出发菌为大肠杆菌。8. 权利要求1或2所述特异DNA分子，或，权利要求3或4所述特异质粒，或，权利要求5至7 中任一所述重组菌在制备吡咯喹啉醌中的应用。9. 一种制备吡咯喹啉醌的方法，包括如下步骤:发酵培养权利要求5至7任一所述重组 菌，得到吡咯喹啉醌。 10. A)或B): A) 融合蛋白，包括如下元件:PqqA蛋白、权利要求1或2中所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、 所述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白； 所述PqqA蛋白为如下(P1)或(P2)或(P3): (P1)权利要求1或2中所述PqqAl蛋白、所述PqqA2蛋白和所述PqqA3蛋白； (P2)权利要求1或2中所述PqqAl蛋白、所述PqqA2蛋白和所述PqqA3蛋白中的任意两个 蛋白； (P3)权利要求1或2中所述PqqAl蛋白、所述PqqA2蛋白或所述PqqA3蛋白； B) 蛋白组合物，由所述PqqA蛋白、权利要求1或2中所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述 PqqD蛋白、所述PqqE蛋白组成。
【文档编号】C12R1/19GK106086052SQ201610512635
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】黄建忠, 柯崇榕, 杨欣伟, 钟璐芳, 任洋, 陶勇
【申请人】福建师范大学