成纤维细胞生长因子21的应用
【专利摘要】本发明涉及一种成纤维细胞生长因子21在制备治疗低氧性肺动脉高压药物的应用、防治肺源性心脏病药物中的应用、防治慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。本发明从动物整体水平和不同细胞水平对FGF21对抗肺血管重建、内皮功能损伤、血管炎症方面的作用做了评估与验证。FGF21可通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达水平，激活PPARγ依赖的信号通路，以改善内皮细胞功能，抑制异常表型的肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞增殖，抑制炎症相关细胞因子分泌，从而有效减轻或缓解慢性低氧诱导的肺动脉高压。
【专利说明】
成纤维细胞生长因子21的应用
技术领域
[0001]本发明涉及医学技术领域，确切的说是成纤维细胞生长因子21的应用。
【背景技术】
[0002]成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21，FGF21)是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，在糖尿病、肥胖症等代谢紊乱相关疾病中具有调节糖脂代谢的保护性作用。近年来FGF21在心血管系统及炎症代谢等方面新的作用陆续被发现，使其可能成为一种有前途的新型血管保护因子。在对体循环血管性疾病的研究中发现，FGF21在心肌细胞、内皮细胞中有表达，外源性给予FGF21可对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤起到一定的保护作用，干预早期动脉粥样硬化的发生。此外，陆续有研究发现FGF21在心脏肥厚、糖尿病性肾病、关节炎等疾病或病理过程中具有抗纤维化的作用。但FGF21在肺循环相关疾病中的作用研究未见报道。
[0003]过氧化物酶体增殖剂激活受体γ (Peroxi someproI if erators_acti vatedreceptor γ，PPAR γ )是一种核内转录因子，可与维甲类X受体形成二聚体复合物，调节核内细胞代谢和分化相关基因的转录。已有多项研究表明，P P A R γ与肺动脉高压(P A H，pulmonary arterial hypertens1n)关系密切。激活PPAR γ可促进其下游基因转录活化，引起内皮细胞凋亡，抑制新生血管生成，同时还可调节血管平滑肌细胞迀移、增殖，直接促进血管舒张，从而抑制PAH发生发展Jang等也报道PAH患者肺组织中PPAR γ蛋白表达下降，平滑肌细胞和内皮细胞的PPARy基因缺陷均可以引起小鼠肺动脉高压形成。在对体循环血管性疾病的研究中发现，FGF21具有保护内皮功能，减轻炎症反应以及抑制纤维化的作用。但FGF21/PPAR γ在肺循环中是否有保护血管内皮细胞功能和抑制肺血管炎症、减轻平滑肌细胞增生作用未见研究。在肺动脉高压、肺血管重塑中FGF21对PPARy是否有调节作用尚未清楚。
【发明内容】
[0004]本发明发明目的在于提供一种基于FGF21在体循环相关疾病及其他病理过程中的已有研究基础，探讨FGF21在对治疗低氧造成的肺血管重构、肺动脉高压的治疗作用，为肺动脉高压、肺心病、慢性阻塞性肺疾病的防治提供一种安全有效的新型蛋白类药物。
[0005]为实现上述目的，本发明通过以下方法研究FGF21在低氧性肺动脉高压病理过程中的作用，以探讨FGF21在低氧性肺动脉高压发生发展过程中是否具有保护作用:
I)通过构建低氧性肺动脉高压大鼠动物模型，证实FGF21干预组mPAP、RV/(LV+S)、WA/TA较低氧组均显著改善，说明FGF21可以抑制低氧造成的肺血管结构重建和低氧性肺动脉高压的形成。且FGF21的保护作用是通过上调PPARy蛋白表达水平，减轻或延缓血管重构过程实现的。具体步骤为:
a.采用右心导管法测定各组大鼠的肺动脉压力、颈动脉压力波形变化，观察FGF21对血流动力学指标平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、平均颈动脉压(mean carotid arterial pressure，mCAP)、右心室/(左心室 + 室间隔)(rightventricle/left ventriele+septum,RV/(LV+S))的影响0
[0006]b.观察各组大鼠肺细小动脉显微结构，比较FGF21对肺血管重建指标肺细小动脉管壁面积/管总面积(vessel well area/total area，WA/TA)、中膜厚度(thickness ofthe medial smooth muscle cell layer, PAMT)、平滑肌细胞核密度(density of nucleiin medial smooth muscle cells, SMC)的影口向。
[0007]2)通过构建肺动脉内皮细胞(Pulmonary artery endothelial cells, PAECs)低氧模型，证实FGF21能够抑制低氧下PAECs异常增殖，改善内皮功能。
[0008]a.采用CCK-8法检测PAECs细胞增殖情况，分光光度法检测细胞胞内caspase3酶活性。
[0009]b.采用ELISA法检测PAECs培养基中内皮源性活性物质N0、ET-1分泌水平。
[0010]3)通过构建肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)低氧模型，证实FGF21能够抑制低氧下PASMCs过度增殖，降低IL-1、IL-6、TNF-a炎症因子分泌水平。
[0011]a.采用CCK-8法检测PASMCs细胞增殖情况。
[0012]b.采用ELISA法检测PASMCs培养基中炎症因子IL-1、IL-6、TNF_a分泌水平。
[0013]4)通过ELISA、免疫组化、western blot方法分别检测各组大鼠血清、肺细小动脉、肺组织匀浆中FGF2UPPAR γ的表达水平，研究FGF21对低氧下内源性FGF21、PPAR γ蛋白表达的影响，明确FGF21在低氧性肺动脉高压中的保护作用与下游PPAR γ蛋白的表达有关。
[0014]结果表明FGF21能够上调内源性FGF21、PPARy蛋白表达，激活下游PPARy依赖的相关信号通路，从而在整体和细胞水平上发挥抑制低氧下肺血管重构、保护内皮功能、减轻血管炎症的保护性作用。表明该药物具有开发成肺动脉高压、肺心病的有效防治药物并用于临床。
[0015]本发明公开了FGF21在低氧性肺动脉高压中的作用，从动物整体水平和不同细胞水平对FGF21对抗低氧肺血管重建、内皮功能损伤、血管炎症方面的作用做了评估，为进一步开发FGF21在肺循环相关疾病中的应用奠定了基础，多位点、多途径验证了FGF21可在低氧性肺动脉高压中发挥保护作用。
[0016]目前研究发现FGF21具有保护内皮功能、减轻炎症、抑制组织纤维化的作用，而临床上低氧性肺动脉高压常伴随着肺血管结构紊乱和慢性炎症，同时结合FGF21具有调节糖脂代谢的作用，故FGF21可能对肺动脉高压合并代谢综合征患者具有良好的疗效。通过现阶段常用药物制剂手段，可以将其制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、分散剂或注射液，并与其它现有肺动脉高压防治药物联合使用。
[0017]本发明的有益效果为:COPD是临床上常见的、多发的慢性疾病，其患病率非常惊人，占我国40岁以上人群的8.2%，全国罹患人数超4000万，肺源性心脏病是COHXf者死亡的重要原因，而由COPD发展成为肺源性心脏病的关键环节为肺动脉高压的形成。随着人们对超声筛查的认识增加及其广泛应用，发病率的提高以及治疗费用的增加，该疾病不仅影响人们的生活质量，也给社会带来了巨大的经济负担，在WHO的疾病负担排序中占我国第一位。而目前肺动脉高压的治疗药物由于其无法逆转肺动脉高压病理过程，或显著地延长患者的生存时间而其应用受到限制。因此，本项目在以往研究基础上继续深入地研究肺动脉高压病理形成机制，探讨FGF21是否能够有效阻断或治疗肺动脉高压，揭示肺动脉高压发生的分子机制，为临床治疗寻找新靶点和新药物提供依据。
【具体实施方式】
[0018]本发明公开的下面结合实施例对本发明技术方案做进一步说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。
[0019]实施例1FGF21在低氧性肺动脉高压中的作用
试验方法:构建在体低氧性肺动脉高压模型，证实FGF21可以抑制肺动脉高压和肺血管重塑，且FGF21是通过上调PPARy表达水平发挥保护作用。
[0020]通过以下步骤完成:
将雄性SD大鼠随机分为A.常氧组;B.低氧组;C.低氧+FGF21干预组。低氧组大鼠均置于开孔式标准气压低氧舱内，保持02为8%_11%，C02浓度保持在〈3%，每日入舱8小时。C组于每次入舱前30min腹腔注射FGF21 400ug/Kg。连续造模4周。
[0021]a.利用PowerLab生理记录分析仪，采用右心导管法分别对各组进行肺动脉压力、颈动脉压力波形采集并测量，发现低氧组较常氧组mPAP从(15.9 ± 2.2)mmHg增加至(23.8 土
0.8 )mmHg，而FGF21干预组较低氧组mPAP降低至(16.8±2.6 )mmHg。上述各组mCAP无明显改变。测量RV/(LV+S)发现低氧组较常氧组RV/(LV+S)从(26.08 ±0.56)(%)增加至(34.36 土2.27)(%)，而?6?21干预组较低氧组1^/(1^+3)降低至(27.82±2.10)(%)。
[0022]b.HE染色法观察各组大鼠肺细小动脉显微结构，并测定各组WA/TA、PAMT、SMC的影响。比较后发现，低氧组大鼠肺细小动脉管腔较常氧组明显狭窄，中膜平滑肌细胞明显增生;FGF21干预组大鼠肺细小动脉管腔狭窄程度、中膜平滑肌细胞增生程度与低氧组相比明显减轻。
[0023]C.采用免疫组化方法，证实FGF21、PPAR γ在大鼠肺脏中均有表达。低氧组大鼠肺细小动脉FGF21 ,PPAR γ平均吸光度值均低于常氧组，而FGF21干预组大鼠FGF21 ,PPAR γ平均吸光度值均显著高于低氧组。采用western blot方法，证实低氧组大鼠肺组织内源性FGF21、PPARy蛋白表达均低于常氧组，而FGF21干预组大鼠内源性FGF21、PPARy蛋白表达则均显著高于低氧组。
[0024]以上实验结果表明，FGF21可以抑制肺血管重建和低氧性肺动脉高压的形成，通过上调PPAR γ蛋白表达是其重要作用机制之一。
[0025]实施例2FGF21对低氧下肺动脉内皮细胞增殖、功能改变的影响
试验方法:构建体外内皮细胞低氧模型，证实FGF21对内皮细胞增殖、分泌功能的影响。
[0026]通过以下步骤完成:
I)购买人PAECs，采用抗⑶31的单克隆抗体免疫荧光染色法鉴定HPAECs并确定细胞纯度。将相同代数的PAECs随机分为:A.常氧组;B.低氧组;C.低氧+FGF21 (800ng/ml)组。所有低氧组均在低氧培养箱中按照5%C02，5%02，90%N2,37 °C的条件培养。常氧组在常氧培养箱中按照5%C02，95%N2，37 °C的条件培养。造模48小时后用于后续检测。
[0027]2)采用CCK-8染色法检测各组PAECs增殖情况，发现与常氧组相比，低氧组PAECs的CCK-8染色法检测的吸光度(absorbance，A)值显著升高，FGF21干预组HPAECs的A值较低氧组明显下降。分光光度法检测HPAECs胞内caSpaSe3酶活性，发现低氧组的caSpaSe3酶活性较常氧组明显降低，而FGF21干预组的caspase3酶活性较低氧组升高。
[0028]3)采用ELISA法检测各组PAECs培养基上清液中N0、ET-1水平，发现与常氧组相比，低氧组NO分泌明显减少、ET-1分泌明显增加；而FGF21干预后PAECs NO分泌显著增多、ET-1分泌显著减少。
[0029]4)采用免疫荧光和western blot法检测各组细胞内源性FGF21及PPARγ蛋白表达的差异，发现低氧组内源性FGF21蛋白较常氧组表达增加，外源性FGF21干预后内源性FGF21蛋白较低氧组表达增加更明显;低氧组PPAR γ蛋白表达较常氧组降低，外源性FGF21干预后PPAR γ蛋白较低氧组表达增加。
[0030]以上实验结果表明，FGF21具有抑制肺动脉内皮细胞低氧性增殖，促进其凋亡，改善内皮功能的作用，而上调其内源性FGF21和PPAR γ蛋白表达可能使其重要机制之一。
[0031]
实施例3 FGF21对低氧下肺动脉平滑肌细胞增殖及炎症反应的影响试验方法:通过构建PASMCs低氧模型，证实FGF21能够抑制低氧下PASMCs过度增殖，降低IL-l、IL-6、TNF_a炎症因子分泌水平。
[0032]I)采用酶消化法获取原代大鼠PASMCs，采用抗a-SM actin的单克隆抗体免疫荧光染色法鉴定PASMCs并确定纯度。将PASMCs随机分为:A.常氧组;B.低氧组;C.低氧+FGF21(800ng/ml)组。所有低氧组均在低氧培养箱中按照5%C02，5%02，90%N2，37 °C的条件，常氧组在常氧培养箱中按照5%C02，95%N2，37 °C的条件，分别培养24小时后进行指标检测。
[0033]2)采用CCK-8染色法检测各组PASMCs增殖情况，发现低氧组PASMCs CCK-8的吸光度A值为较常氧组显著升高。FGF21干预组PASMCs A值较低氧组明显降低。
[0034]3)采用ELISA法检测各组PASMCs的炎症因子分泌水平，发现低氧组IL-1、IL-6、TNF-α均较常氧组显著升高。FGF21干预组IL-1、IL-6、TNF_a均较低氧组明显下降。
[0035]4)对2)、3)实验结果进行相关分析发现，各组PASMCs吸光度A值与TNF-a、IL-1、IL-6表达均呈正相关，提示肺动脉平滑肌细胞增殖与上述炎症因子表达量有密切关联。
[0036]以上实验结果表明，FGF21可减少低氧下PASMCs炎症因子的释放，抑制平滑肌细胞增殖。
【主权项】
1.一种成纤维细胞生长因子21的应用，其特征在于:成纤维细胞生长因子21在治疗低氧性肺动脉高压药物中的应用。2.—种成纤维细胞生长因子21的应用，其特征在于:成纤维细胞生长因子21在防治肺源性心脏病药物中的应用。3.—种成纤维细胞生长因子21的应用，其特征在于:成纤维细胞生长因子21在防治慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。4.根据权利要求1或2或3所述成纤维细胞生长因子21的应用，其特征在于:该药物制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、分散剂或注射液。
【文档编号】A61P9/00GK105833248SQ201610267568
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】黄晓颖, 王良兴, 黄志峰, 蔡慧, 平伟东, 陈阿丽, 姚丹
【申请人】温州医科大学附属第医院, 温州医科大学附属第一医院