用于可溶性成纤维细胞生长因子受体的灵敏的多重免疫测定的制作方法
【专利说明】用于可溶性成纤维细胞生长因子受体的灵敏的多重免疫测 定
[0001] 优先权申请
[0002] 本申请要求2012年12月21日提交的美国申请61/740, 466的优先权，其全文以 引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 本文描述且受权利要求书保护的主题处于分析物检测领域，并且具体地，涉及用 于测量和鉴定生物样本中可溶的或细胞外域的成纤维细胞生长因子受体的试剂盒和方法， 所述受体包括2型受体、3型受体和4型受体（SFGFR2、SFGFR3和SFGFR4)。
【背景技术】
[0004] 癌变为多步过程，在此过程中，正常细胞通过积累多个基因突变并获得多个促进 恶性表型的常见特征（常称为癌标志）而转化成癌细胞。六个经典的癌标志包括生长信 号中的自给自足、对抗生长信号的不敏感、无限复制、细胞凋亡逃逸、持续的血管生成、以及 侵入组织并形成癌细胞转移的能力（Hanahan，D.，Weinber，R.A. Cell 2000, 100:57-70)。 这些特征中的许多是由基因改变引起的，所述基因改变涉及关键癌基因的功能获得、扩增 和/或过表达，以及瘤抑制因子的功能丧失、缺失和/或外基因沉默（Luo, J.，Solimini，N. L. ，Elledge，S. J. Cell 2009, 136:823-837)。例如，已在多种人癌中鉴定出许多改变和突 变处于成纤维细胞生长因子受体（FGFR)家族内。这些突变导致FGFR信号传导反常或癌 中受体过表达，所述癌包括乳腺癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤，以及尤 其肺癌（Turner, N.，Grose, R.，Nat Rev Cancer. 2010, 10:116-129 ;Volm，M.，Koomiigi, R. , Mattern, J. , Stammler, G. Eur J Cancer. 1997, 33:691-693 ；Bergsagel, P. L. , Kuehl, W. M. J Clin Oncol. 2005, 23 :6333_6338。Trudel，S.，Stewart，A. K.，Rom，E.，Wei，E.，Li，Z. H. ,Kotzer, S. , Chumakov, I. , Singer, Y. , Chang, H. , Liang, S. B. , Yayon, A. , Blood. 2006, 107 ： 4039-4046)。
[0005] 对于男性和女性而言，肺癌是癌症相关死亡的主要原因，并且2010年美国统计 有 157, 300 死亡例（Jemal，A.，Siegel，J.Xu，J.，Ward，E.CA Cancer J Clin. 2010, 60: 277-300)。大多数肺癌病例（大约85%)归类为非小细胞肺癌（NSCLC)，在过去几十年 中，肺癌幸存者的改善最小（American Cancer Society. Cancer Facts&Figures，2010， Atlanta，GA)。近来，由于对NSCLC中生长因子信号传导了解的提高，而兴起了把表皮生长 因子受体（EGFR)和血管内皮生长因子（VEGF)作为目标的新型治疗方法。尽管EGFR抑制 剂在未选择患者中表现出一些优势，但在EGFR中激活突变鉴定瘤亚群异常灵敏于EGFR酪 氨酸激酶抑制剂（Lynch, T. J.，Bell, D. W.，Sordella, R.，Gurubhagavatula, S.，Okimoto, R. A. , Brannigan, B. W. , Harris, P. L. , Haserlat, S. M. , Supko, J. G. , Haluska, F. G. , Louis, D. N. ，Christiani，D. C.，Settleman，J.，Haber，D. A. N Engl J Med. 2004, 350 :2129_2139 ; Shepherd, F. A. , Pereira, J. R. , Ciuleanu, T. , Eng, H. T. , Hirsh, V. , Thongprasert, S. , Cam pos, D. , Maoleekoonpiroj, S. , Smylie, M. , Martins, R. , Van Kooten, M. , Dediu, M. , Findla y, B. , Tu, D. , Johnston, D. , Bez jak, A. , Clark, G. , Santabarbara, P. , Seymour, L. N Engl J Med. 2005, 353:123-132)。类似地，对于患有NSCLC的某些患者，抗VEGF治疗方法产生了改 善的结果（Sandler, A.，Gray, R.，Perry, M. C.，Brahmer, J.，Schiller, J. H.，Dowlati, A.，Li lenbaum, R.，Johnson, D. H. N Engl J Med. 2006, 355:2542-2550)，尽管未达到定义抗 VEGF 疗效的预测生物标志（Ramalingam，S.S.，Belani，C.P.Curr Opin Oncol. 2010, 22:79-85)。 NSCLC中EGFR和VEGF抑制剂的经验强调需要定义其他信号传导途径，所述其他信号传导途 径涉及瘤进展、血管生成和对当前可用治疗方法的抵抗（Siegel, R.，Naishadham, D.，Jemal ,A. CA Cancer J Clin. 2012, 62 ： 10-29)〇
[0006] 成纤维细胞生长因子受体（FGFR)为涉及多个生理过程的跨膜酪氨酸激酶受体， 所述多个生理过程包括血管生成、器官生成、组织发育和内分泌信号传导。结构上，FGFR 由裂解的信号肽、三个免疫球蛋白（Ig)样域、酸性盒、跨膜域和分离的酪氨酸激酶域组 成（Turner, N.，Grose, R. Nat Rev Cancer. 2010, 10:116-29 ;Beenken，A.，Mohammadi，M. Nat Rev Drug Discov. 2009,8:235-253)。迄今为止，已鉴定出FGFR编码的四种基因， 命名为FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。每种类型的FGFR的灵敏度和特异性不同。该体 系通过可在FGFRl-3mRNA中发生的延伸拼接而进一步复杂化，从而生成具有不同配体结 合和信号转导活性的多种变体（Turner，N.，Grose，R. Nat Rev Cancer. 2010, 10:116-29; Beenken, A.，Mohammadi, M. Nat Rev Drug Discov. 2009, 8 :235_253)。成纤维细胞生长因子 (FGF)为FGFR的配体并由根椐细胞需要而释放的二十二种可溶性排泄肽组成。而且，FGF 和FGFR产生使生长信号精确微调的极高数量的配体/受体组合。FGF信号传导的调节涉及 多个机制，包括释放可溶形式的FGFR(sFGFR)，其由金属蛋白酶在细胞表面处的蛋白水解裂 解而生成（MUllberg J，Althoff K，Jostock T，Rose_John S.Eur Cytokine Netw. 2000, 11 : 27-38)。这些受体的脱落提供了关于FGF信号传导下调和生物活性蛋白释放到循环 的关键机制（Peschon J. J.，Slack J. L.，Reddy P.，Stocking K. L.，Sunnarborg，S. ff. , Lee, D. C. , Russell, ff. E. , Castner, B. J. , Johnson, R. S. , Fitzner, J. N. , Boyce, R. ff. , Nelson, N. , Kozlosky, C. J. , ffolfson, M. F. , Rauch, C. T. , Cerretti, D. P. , Paxton, R. J.，March, C. J.，Black, R. A. Science. 1998282 :1281-2184) 〇
[0007] 在过去二十年中，有显示癌患者中血液内存在相当高水平的可溶性FGFR受体 的确凿证据（Hanneken，A.，Ying，W.，Ling，N.，Baird，A.Proc Natl Acad Sci. 1994,91: 9170-9174 ;Hanneken A. FEBS Lett. 2001，489 :176-181)，这表明在循环中监测这 些受体的存在可能对于了解癌的进展和/或治疗方法至关重要。例如，C-末端 截断的可溶形式的FGFR4由能在功能上调节FGF作用的人上皮乳腺癌细胞系表 达(Ezzat, S, Zheng, L. , Yu, S. , Asa, S. L. Biochem Biophys Res Commun。2001,287: 60-65)。此外，已在人鳞状癌细胞系中鉴定出另选拼接形式的FGFR3,其具有结合至 FGF1 和 FGF2 的潜力，如交联实验所不（Terada, M.，Shimizu, A.，Sato. N.，Miyakaze，S. I.，Katayama，H.，Kurokawa-Seo.M. Mol Cell Biol Res Commun. 2001，4:365-373)。这些分 泌的sFGFR的配体结合亲和力常类似于这些受体的膜结合形式，这表明它们的生物作用是 通过与细胞表面受体竞争而调节配体的作用。
[0008] 尽管这些研宄中的一些已在血液或细胞培养基中鉴定出FGFR，而现有技术中使 用的唯一方法为免疫印迹法（Hanneken, A.，Ying, W.，Ling, N.，Baird, A. Proc Natl Acad Sci. 1994, 91 :9170-9174 ;Hanneken A. FEBS Lett. 2001, 489 :176-181)，这是一种非灵敏 的、线性的或诊断的技术。因此，对经得起检验自动化的sFGFR的标准化、快速、精确和 经济筛选的研发需求仍未被满足。由于可商购获得的DuoSetK抗体可检测可溶形式的 总FGFR2、FGFR3和FGFR4,故本申请人使用ELISA方法来研发类似于用于检测可溶性表 皮生长因子受体的 sFGFR 的检测测定（Muller, V.，Witzel, I.，Pantel, K.，Krenkel, S.， Luck, H. J. , Neumann, R. , Keller, T. , Dittmer, J. , Janicke, F. , Thomssen, C. Anticancer Res. 2006, 26:1479-1487)。然而，因为DuoSetELISA体系仅在所测定的生物样本中检 测可溶性FGFR3 (SFGFR3)，故其不令人满意。继而，本申请人将该测定转到Meso Seale Discovery形式以提高对可溶性FGFR2(sFGFR2)和FGFR4(sFGFR4)的检测灵敏度。然而，仍 未检测到SFGFR2和SFGFR4。因此，成功研