发出了检测生物样本中SFGFR2、SFGFR3和SFGFR4 的完全不同的测定体系，该体系利用多重的、基于微球的平台。本文所公开的主题提供了用 于检测生物样本中sFGFR2、SFGFR3和SFGFR4的试剂盒和方法。
【发明内容】
[0009] 与无疾病的患者相比，癌症患者在他们的生物流体和组织中通常具有较高的可溶 性FGF受体含量。本文所述的试剂盒和方法可使本领域的技术人员鉴定和定量此类患者中 可溶性FGF受体的多个同种型并为鉴定和定量肿瘤患者中FGF含量提供基础。本文所述的 本发明的另一个实施例也属于同时筛选sFGFR的多重微球技术。
[0010] 实施例描述的方面中的第一方面为用于检测SFGFR的试剂盒。该试剂盒包含缀合 至微球的特异性结合sFGFR的捕获抗体组合物。具有缀合的捕获抗体的微球具有约5 ym 的直径和两种荧光团。每种荧光团在光谱上不同于另一荧光团。该试剂盒还包含特异性结 合sFGFR却不同于捕获抗体的检测抗体组合物，并且该检测抗体缀合至本领域中已知的适 用于所述指定用途的任何可检测的标记。此外，该试剂盒可包含封闭缓冲液和孵育缓冲液。
[0011] 第二实施例包括用于检测sFGFR2、SFGFR3和/或SFGFR4的某个预定义的阈值水 平的试剂盒。优选地，此类水平在具有如下值的水平下检测：生物样本中至少〇. 14_494ng/ mL 的 sFGFR2、0. 23-74ng/mL 的 sFGFR3 和 0. 33-123ng/mL 的 sFGFR4。该试剂盒包含缀合至 微球的sFGFR2、sFGFR3和SFGFR4的捕获抗体和缀合至本领域中已知的检测标记的SFGFR2、 SFGFR3和SFGFR4的检测抗体。该试剂盒还可包含封闭缓冲液和孵育缓冲液。
[0012] 本文描述且受权利要求书保护的主题的第三实施例包括用于测量生物样本中 sFGFR2、SFGFR3和/或SFGFR4的量的方法。该方法包括使生物样本与缀合在微球上的特 异性结合sFGFR的捕获抗体组合物接触，使生物样本与偶联至本领域中已知的检测标记的 特异性结合sFGFR的检测抗体组合物接触，测量由检测标记产生的信号，以及使所产生的 信号的量与生物样本中sFGFR2、SFGFR3和/或SFGFR4的量相关联。
[0013] MM
[0014] FGF 成纤维细胞生长因子
[0015] FGFR 成纤维细胞生长因子受体
[0016] FGFRs (多种）成纤维细胞生长因子受体
[0017] sFGFR 可溶性成纤维细胞生长因子受体
[0018] sFGFR2可溶性成纤维细胞生长因子受体2
[0019] SFGFR3可溶性成纤维细胞生长因子受体3
[0020] SFGFR4可溶性成纤维细胞生长因子受体4
[0021] sFGFRs (多种）可溶性成纤维细胞生长因子受体
[0022] NSCLC 非小细胞肺癌
[0023] ADAM 去整合素
[0024] ELISA 酶联免疫吸附测定
[0025] MSD Meso Scale Discovery
[0026] EDTA 乙二胺四乙酸
[0027] BSA 牛血清白蛋白
[0028] LDD 最小可检测剂量
[0029] CV 变异系数
[0030] LL0Q 定量下限
[0031] RTKI 受体酪氨酸激酶抑制剂
[0032] VEGF 血管内皮生长因子
[0033] PDGFR 血小板衍生生长因子受体
[0034] 定义
[0035] 如本文所用，术语"试剂盒"是指试剂和其他材料的组合。试剂盒预期可包含试剂， 诸如缓冲剂、蛋白稳定试剂、信号产生体系（例如，荧光信号生成体系）、抗体、对照蛋白、以 及测试容器（例如，微量滴定板等）。术语"试剂盒"不旨在限于试剂和/或其他材料的特 定组合。在一个实施例中，试剂盒还包含使用试剂的说明。测试试剂盒可以任何合适的方 式包装，通常，其具有处于单个容器或（必要时）处于多个容器的成分以及用于进行测试的 一张说明书。在一些实施例中，试剂盒还优选地包括阳性对照样本。可以本领域中已知的 多种方法来制备试剂盒。
[0036] 术语"生物样本"涵盖从生物体获得的多种样本类型，并且其可用于诊断或监测测 定。该术语涵盖血液和其他生物源液体样本、固体组织样本，诸如活检标本或来源于其的 组织培养物或细胞和其子代。该术语涵盖已在取得它们后以任何方式（诸如用试剂处理、 溶解、或富集某些组分）操作的样本。该术语涵盖临床样本，并且还包括细胞培养物中的细 胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样本。术语"生物样本"意在区分 临床环境中的样本与可为重组样本或来源于重组样本的样本。
[0037] 就本申请的意义而言，术语"捕获抗体"和"检测抗体"旨在涵盖以高亲和力与特 异性sFGFR结合的那些抗体。
[0038] 术语"抗体"在广义上使用，并且具体地，涵盖完整的单克隆抗体，多克隆抗体，由 至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体（例如，双特异性抗体），以及抗体片段（只要其 表现出所需生物特性）。抗体可来源于任何物种且可为例如IgM、IgG(例如，IgGl、IgG2、 IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。所需生物活性为与sFGFR的结合。
[0039] 如本文所用，术语"单克隆抗体"是指制备的单分子组合物的抗体。单克隆抗体组 合物显示出单一结合特异性以及对sFGFR特定表位的亲和力。
[0040] 如本文所用，术语"多克隆抗体"是指不同的抗体分子的组合物，其能够与同一或 不同抗原上的多个不同特异性抗原决定簇结合或反应。多克隆抗体的抗原特异性的变异 度位于构成多克隆抗体的单个抗体的可变区中，具体地，位于互补决定区（CDR)l、CDR2和 ⑶R3区。优选地，多克隆抗体通过用靶sFGFR或其部分免疫动物来制备。另选地，多克隆抗 体可通过将具有所需靶sFGFR特异性的多个单克隆抗体混合来制备。
[0041] 术语"特异性结合"是指两种分子间的结合，例如，抗原和抗体，其特征在于即使在 存在许多其他不同分子情况下某一分子（抗原）与另一特异性分子（抗体）结合的能力， 即，显示出在非均相分子混合物中优先将一种分子与另一种分子结合。
[0042] 术语"微球"是指小的离散的固体载体。这些离散的固体载体可用于连接探针组， 使得所述组中的每个单独探针彼此不同。微球组合物可依据例如形式、化学过程和/或连 接方法和/或核酸合成方法而变化。示例性微球组合物包含固体载体，并且赋予其化学功 能，用于多核苷酸、多肽和/或有机部分的合成中。此类组合物包含例如塑料，陶瓷，玻璃， 聚苯乙烯，甲基苯乙烯，丙烯酸类聚合物，顺磁性材料，氧化钍溶胶，碳石墨，二氧化钛，胶乳 或交联的右旋糖酐诸如琼脂糖，纤维素，尼龙，交联的胶束和Teflon?，以及任何其他材料。
[0043] 如本文所用，术语"荧光团"是指可用于定量和检测sFGFR抗原的任何荧光化合物 或荧光蛋白。
[0044] 术语"灵敏度"本质上为本发明所述的多重测定正确鉴定最小浓度的特异性sFGFR 的程度的量度。如本文所述，灵敏度定义为可准确回收80-120%的特异性sFGFR的最小可 检测剂量（ng/mL)。
[0045] 术语"缓冲液"是指缓冲溶液或水。缓冲液维持感兴趣分析物（例如，sFGFR)和分 析物结合剂（例如，sFGFR抗体）之间的反应且不妨碍抗体/抗原相互作用。
[0046] 如本文所用，术语"活体受检者"是指任何活生物体，包括人。
[0047] 如本文所用，说明书中术语"一个"或"一种"可指一个（种）或多个（种）。如本 文权利要求中所用，当与词语"包含（包括）" 一起使用时，词语"一个"或"一种"可指一个 (种）或多于一个（种）。如本文所用，"另一个"可指至少第二个或更多。
[0048] 如本文所用，术语"包含（包括）"或变型诸如"含有"或"具有"可用于暗示包含 所述元素或整体，或者元素或整体的组，但不排除任何其他元素或整体，或者元素或整体的 组。
[0049] 除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域的 普通技术人员一般理解相同的含义。
【附图说明】
[0050] 图1 :使用针对可溶性FGFR2、FGFR3和FGFR4研发的测定而建立的用于血清和血 浆的校验参数。
[0051] 图 2 :血清和血浆中浓度为 7. 8ng/mL、2. 9ng/mL、1. 7ng/mL 和 0? 82ng/mL 的 FGFR2 的加标-回收（N = 3)。
[0052] 图 3 :血清和血衆中浓度为 1. 4ng/mL、0. 57ng/mL、0. 30ng/mL 和 0? 15ng/mL 的 FGFR3的加标-回收（N = 3)。
[0053] 图 4 :血清和血衆中浓度为 2. 2ng/mL、0. 94ng/mL、0. 54ng/mL 和 0? 29ng/mL 的 FGFR4的加标-回收（N = 3)。
[0054] 图5 :下列物质的交叉反应性：捕获时FGFR3和FGFR4与抗FGFR2,捕获时FGFR2和 FGFR4与抗FGFR3,以及捕获时FGFR2和FGFR3与抗FGFR4。
[0055] 图6 :标示浓度（ng/mL)对反算浓度（ng/mL)的FGFR2的标准曲线（N = 5)。
[0056] 图7 :标示浓度（ng/mL)对反算浓度（ng/mL)的FGFR3的标准曲线（N = 5)。
[0057] 图8 :标示浓度（ng/mL)对反算浓度（ng/mL)的FGFR4的标准曲线（N = 5)。
[0058] 图9 :在掺加低浓度、中浓度和高浓度分析物的运行之间的对照样本中FGFR2血清 浓度的实验评定（N = 5)。
[0059] 图10 :在掺加低浓度、中等浓度和高浓度分析物的运行之间的对照样本中FGFR3 血清浓度的实验评定（N = 5)。
[0060] 图11 :在掺加低浓度、中等浓度和高浓度分析物的运行之间的对照样本中FGFR4 血清浓度的实验评定（N = 5)。
[0061] 图 12 :血清（N = 3)和血衆（N = 3)中浓度为 7. 8ng/mL、2. 9ng/mL、1. 7ng/mL 和 0? 82ng/mL 的 FGFR2,浓度为 1. 4ng/mL、0. 57ng/mL、0. 30ng/mL 和 0? 15ng/mL 的 FGFR3,以及 浓度为 2. 2ng/mL、0. 94ng/mL、0. 54ng/mL 和 0? 29ng/mL 的 FGFR4 的加标-回收数据。
[0062] 图13 :血浆、血清和高加标对照中FGFR2的稀释线性度数据。
[0063] 图14 :血浆、血清和高加标对照中FGFR3的稀释线性度数据。
[0064] 图15 :血浆、血清和高加标对照中FGFR4的稀释线性度数据。
[0065] 图16 :顶栏：用于在前列腺癌血清和肺癌血