犬成纤维细胞生长因子21及其在治疗犬内分泌疾病中的用图
【技术领域】
[0002] 本发明涉及犬成纤维细胞生长因子及其制备方法，本发明还涉及该犬成纤维细胞 生长因子在制备治疗犬内分泌疾病药物中的用途，属于犬成纤维细胞生长因子领域。
【背景技术】
[0003] 随着宠物犬饲养量的上升，肥胖及老龄犬数量的增多，随之而来犬的代谢性、老年 性疾病，如糖尿病及其并发症的发病率呈逐渐增加的趋势。在小动物临床诊疗中，糖尿病 (DiabetesMellitus，DM)是犬最常见的代谢内分泌疾病之一。主要发生于中、老龄犬，并 且患病率正在逐年升高。犬通常在7-9岁时开始发病，其发病率为0. 1%_0. 6%，雌犬是雄犬 的3倍，多于发情后发病，多见于基斯犬、小型髯犬、小型狮子犬、腊肠犬、西摩族犬等犬种。
[0004] 糖尿病患犬的诊断与治疗和人糖尿病大体相同，但对犬糖尿病发病机制及治疗的 研究远远没有跟上人糖尿病研究的步伐。据统计，中国约有1. 5亿只宠物狗，糖尿病狗约为 70万只。目前犬类糖尿病治疗药物主要有磺酰脲类和胰岛素，对肥胖和高血脂症还没有专 门的药物。这些治疗糖尿病的药物对肥胖和高血脂症没有治疗作用，而且降糖持续时间短， 通常只能维持2个小时左右，一天内需要多次给药。此外，用于治疗犬糖尿病的常用胰岛素 主要是人或猪胰岛素，与犬代谢系统的相容性较差。因此，临床上迫切需要研制适合于犬类 专用、具有长效作用，同时能降脂、减肥的降糖药物。
[0005] 人成纤维细胞生长因子21 (Fibroblastgrowthfactor21，FGF21)是最新发现 的与糖脂代谢有关的因子。FGF21可以特异性调节鼠3T3-L1脂肪细胞和人脂肪细胞对葡 萄糖的摄取；FGF21可以改善胰岛素抵抗，保护胰岛细胞的存活；FGF21能促进脂肪组织中 的葡萄糖吸收，减少脂肪堆积，并可在过氧化物酶体增生物激活受体PPAR调节下，可以作 为肝脏中稳定的脂类调节剂，避免脂肪肝的发生。因此有国外学者预言，FGF21有望替代胰 岛素成为治疗糖尿病的一代新药。
[0006] 犬FGF21与人FGF21核苷酸同源性为82. 15%，氨基酸同源性为86. 81%，因此，犬 FGF21同样也具有调节血糖血脂的能力。本实验室在动物模型中发现犬FGF21可以升高血 清胰岛素浓度，显著降低血糖，显示其具有治疗犬糖尿病及犬内分泌疾病的潜能。
[0007]
【发明内容】
： 本发明的目的之一是提供犬成纤维细胞生长因子21及其编码基因； 本发明目的之二是提供含有犬成纤维细胞生长因子21基因的原核表达载体或质粒以 及含有该原核表达载体的宿主细胞。
[0008] 本发明目的之三是将该犬成纤维细胞生长因子21应用于制备成治疗犬糖尿病及 犬内分泌疾病的药物或药物组合物。
[0009] 本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的： 一种犬成纤维细胞生长因子21 (CFGF21)，其氨基酸序列为SEQIDN0:2所示；编码该 犬成纤维细胞生长因子21 (cFGF21)的核苷酸序列为SEQIDN0:1所示。
[0010] 获得本发明所述的CFGF21的方法，包括如下步骤：从正常犬肝脏中提取RNA，并以 此为模板逆转录获得编码CFGF21的基因，以此为模板，通过PCR获得CFGF21基因，将所获 得的CFGF21基因连接到原核表达载体中；将所述重组原核表达载体转化适当的宿主细胞， 并进行诱导表达、纯化。
[0011] 含有CFGF21核苷酸序列的重组原核表达载体以及含有该重组原核表达载体的宿 主细胞也包括在本发明的保护范围之内。优选的，可以将CFGF21核苷酸序列与携带分子伴 侣的原核表达载体相连接。其中，所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白（SUM0)。
[0012] 本发明还提供了一种制备CFGF21的方法，包括：将携带CFGF21核苷酸序列的重组 原核表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达CFGF21融合蛋白，分离纯化CFGF21融合蛋白， 利用SUM0蛋白酶切除与CFGF21融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。
[0013]优选的，所述的原核表达载体为pSUM0(Cat.No. 1005，1006,LifeSensors)，所 述的宿主细胞为R〇ssetta(DE3)(上海宝曼生物科技有限公司，目录号：130558-10);所述 的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白（SUM0);其中，所述的纯化包括：将融合蛋白进行 树脂亲和层析，依次经洗涤、洗脱、脱盐；纯化的融合蛋白酶切后进行树脂亲和层析，即得。
[0014] 优选的，对于蛋白纯化，所述的亲和层析树脂为Ni·NTA树脂；所述的杂蛋白洗脱 液包括：50mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，50mmol/LTris_HCl，pH8· 0;所述的洗脱液 包括：500mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，50mmol/LTris-HCl，pH8.0 ;所述的脱盐采 用HiPr印TM26/10Desalting。
[0015]pSUMO和大肠杆菌Rossetta(DE3)都可通过商业途径购买得到。
[0016] 本发明在获得了CFGF21基因后，与原核表达载体pSUMO重组，导入宿主细胞中，经 过一系列的蛋白纯化步骤后获得了CFGF21蛋白，并对纯化后的CFGF21进行活性检测。
[0017] 本发明所制备的CFGF21是通过糖尿病模型鼠和糖尿病模型犬来检测其治疗糖尿 病效果的。动物学试验结果表明，本发明CFGF21能够有效降低糖尿病模型动物的血糖水 平，此外，本发明CFGF21在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本发 明的CFGF21可作为药物治疗犬糖尿病，肥胖，代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。
【附图说明】
[0018]图 1pSUM0_cFGF21 质粒鉴定 1:A-EcoT14IdigestDNAMarker2 :pSUM0-cFGF21 质粒 3:NotI酶切鉴定 4:PCR鉴定 5:DL2000DNAmarker 图2SUM0-cFGF21融合蛋白表达 1 :蛋白marker2 :IPTG诱导前3 :IPTG诱导后蛋白表达总量4 :IPTG诱导后可溶性蛋 白表达量5 :IPTG诱导后沉淀蛋白表达量 图3CFGF21蛋白制备 1 :蛋白marker2 :cFGF21 图4HPLC分析cFGF21蛋白纯度 经过HPLC分析，在大约21min处出现CFGF21蛋白峰，且其纯度可达95%以上。
[0019] 图5cFGF21刺激后3T3-L1脂肪细胞糖吸收的变化 空细胞糖吸收约27%，10 11111〇1/1〇?6?21刺激后增加至约33%，100 11111〇1/1〇?6?21刺 激后增加至约44%，1000nmol/LCFGF21刺激后增加至约54%。
[0020] 图 6 0GTT 口服葡萄糖后30min，模型组血糖显著上升，且30min后下降比较缓慢，CFGF21治疗组 血糖显著低于模型组，并且血糖在60min已降至接近正常鼠血糖。*p〈0.05，**p〈0.01，与 模型组相比；#P〈〇.05，##p〈0.01，与正常组相比。
[0021] 图7 30天内各组小鼠血糖的变化 模型组血糖始终维持较高的水平，CFGF21治疗3天，血糖较模型组显著下降，治疗6天 后血糖维持在较低的水平接近正常组小鼠血糖水平。*p〈〇. 05，**p〈0. 01，与模型组相比； #ρ〈0·05, ##ρ〈0·01，与正常组相比。
[0022] 图8小鼠血清胰岛素含量 模型组小鼠血清胰岛素含量显著下降，而CFGF21治疗组血清胰岛素含量相较于模型 组得到显著的提高。*ρ〈〇·〇5，#ρ〈(λ01，与模型组相比；#ρ〈(λ05，##ρ〈0·01，与正常组相 比。
[0023] 图9糖化血红蛋白水平 注射30天后，模型组糖化血红蛋白含量维持在较高的水平，而CFGF21治疗组糖化血红 蛋白水平显著下降。*Ρ〈〇·〇5，#ρ〈0·01，与模型组相比；#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，与正常组相 比。
[0024] 图10G6Pase基因的表达量 模型组肝脏内G6Pase表达量显著升高，而CFGF21治疗组小鼠肝脏内G6Pase表达量显 著下降。*ρ〈〇·〇5，#ρ〈0·01，与模型组相比；#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，与正常组相比。
[0025] 图11PCK基因的表达量 模型组肝脏内PCK基因表达量显著升高，而CFGF21治疗组小鼠肝脏内PCK基因表达量 显著下降。*ρ〈〇·〇5，#ρ〈0·01，与模型组相比；#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，与正常组相比。
[0026] 图12、13G6Pase和PCK蛋白的表达量 模型组肝脏内G6Pase和PCK蛋白表达量显著升高，而CFGF21治疗组小鼠肝脏 内G6Pase和PCK蛋白表达量显著下降。*p〈0.05，#p〈0.01，与模型组相比；#p〈0.05， ##ρ〈0· 01，与正常组相比。
[0027] 图14胰腺HE染色以及免疫组化结果 模型组小鼠胰腺胰岛破坏比较严重，分泌胰岛素的量显著降低，而CFGF21治疗组小鼠 胰岛相较于模型组得到显著的改善。
[0028] 图15糖尿病犬血糖的变化 注射12天内，模型组犬的血糖始终维持在较高的水平，而相较于模型组，CFGF21治疗 组2天后，犬的血糖显著下降，治疗4天后血糖维持在较低的水平，接近正常组犬的血糖。 *ρ〈0·05，#ρ〈0·01，与模型组相比；#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，与正常组相比。
[0029] 图16糖尿病犬血清胰岛素水平 模型组犬血清胰岛素含量显著下降，而CFGF21治疗组血清胰岛素含量相较于模型组 得到显著的提高。*Ρ〈〇.05，#ρ〈0.01，与模型组相比；#ρ〈0.05，##ρ〈0.01，与正常组相比。
[0030] 图17糖尿病犬G6Pase基因的表达量 模型组犬肝脏内G6Pase基因表达量显著升高，而CFGF21治疗组犬肝脏内G6Pase基因 表达量显著下降。*P〈〇. 05，#p〈0. 01，与模型组相比；#p〈0. 05，##p〈0. 01，与正常组相比。
[0031] 图18糖尿病犬PCK基因的表达量 模型组犬肝脏内PCK基因表达量显著升高，而CFGF21治疗组犬肝脏内PCK基因表达量 显著下降。*ρ〈〇·〇5，#ρ〈0·01，与模型组相比；#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，与正常组相比。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0033] 说明：本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆，原核表达载体的构建，核酸提取 及序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进 行（参见CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0034] 实施例1 CFGF21基因的克隆 根据CFGF21基因去除信号肽的氨基酸序列，设计引物，通过互补延伸的方法获得去除 信号肽的CFGF21基因。利用在线软件Primer5. 0设计CFGF21引物。