成纤维细胞生长因子21在急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学特别是蛋白检测领域，尤其是具体涉及一种血清中的蛋白 在诊断和治疗急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝中的作用。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体内最大的代谢器官，是许多重要物质代谢、贮存，解毒、排泄代谢产物， 维持水电解质平衡，调整激素代谢、免疫功能的中心站。肝脏在保护机体的同时，又易被各 种毒物、药物以及化合物的代谢产物损伤。当肝脏发生病理改变时，还会导致全身代谢物、 血液循环系统、消化系统、内分泌系统等改变，并影响到内源性小分子代谢物的转归。肝病 的发生率一直占据各类疾病的前列。一项综合了 48项调查，累积356357个样本的流行学 调查结果表明，非酒精性脂肪肝的比例达到20. 09% (17.95-22. 31% )。同时，一项包含 3543个样本的社区临床研究表明，脂肪性肝病的发生率为17. 2%，其中酒精性脂肪肝，疑 似酒精性脂肪肝，和非酒精性脂肪肝的发病率分别为〇. 4%，1. 8%和15. 0%。2008年肝癌 的发病病例达402208例，占所有癌症的14. 3%，肝癌死亡病例达372079例，占所有癌症的 19.0%。肝癌的发病率达23. 7/100000,在所有癌症类型中排名第三。肝癌以成为中国的一 项主要的公共健康事件,其发生率和死亡率都在逐年增加。
[0003] 近年来，随着临床用药种类的迅速增加及患者自行服药或随意加大药物剂量的概 率增加，药物性急性肝损伤的发生率亦相应增加。急性肝功能衰竭是一种少见但是致死率 相对较高的疾病。急性肝损伤或者急性肝功能衰竭的诱因有很多，包括（1)病毒性肝炎 (甲、乙、丙等）；（2)化学物中毒：对乙酰氨基酚、甲基多巴、硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利 福平、氟烷、阿司匹林、四氯化碳、水杨酸、黄磷等，可能引起肝衰竭。（3)外科病症：肝衰竭 可能在手术、创伤、休克等的病人中发生，常原先有肝硬化、阻塞性黄疸等肝功能障碍；在多 器官功能障碍综合症中也可有肝衰竭。（4)其他：妊娠期（多在后3个月）、Wilson病等过 程中也可发生肝衰竭。药物引发的急性肝功能衰竭是药物致死的表现和最主要的原因。同 时，药物引发的急性肝功能衰竭也是很多药物停用的主要原因。药物引发的急性肝功能衰 竭的发生率非常低，在西方国家，大概在十万分之十四。在所有的急性肝功能损伤中，其中 由药物引发的占10-52%。
[0004] 除了药物能够引起急性肝功能衰竭外，一些化学物质也能引发急性肝功能衰竭。 大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏有毒性的物质，称为"亲肝毒物"，例如 三硝基甲苯、四氯化碳、砷、汞、二硝基酚、乙醛、有机磷等。这些毒物在人群中普遍易感，潜 伏期短，病变的过程与感染的剂量直接相关，可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变 形、肝硬化和肝癌。四氯化碳、黄磷等可干扰脂蛋白的合成与转运。四氯化碳还能在体内代 谢产生一种氧化能力很强的中间产物，导致生物膜上的脂质过氧化，破坏膜的磷脂，改变细 胞的结构与功能。
[0005] 急性肝功能衰竭在不同的地区，其主要的诱因也不同。在西方国家，对乙酰氨基酚 是最主要的肝衰竭的原因，而由其他正常剂量非对乙酰氨基酚药物所占的比例和由甲型肝 炎病毒与乙型肝炎病毒的两者引起的比例大约持平。对乙酰氨基酚引发的死亡率在32%到 50%之间。对乙酰氨基酚（醋氨酚），具有抗热镇痛的作用，目前国内多种抗感冒药物的主 要成分，包括：白加黑，泰诺，感冒灵胶囊，快克，速效伤风胶囊，银得菲，999感冒灵冲剂等 等。在英国和美国，对乙酰氨基酚被认为是目前已知的一个能够引起急性肝功能衰竭的药 物。在非洲和亚洲，急性肝功能衰竭的主要诱因是病毒性肝炎，而在欧洲和北美地区，药物 毒性占据急性肝衰的主要诱因。在中国，药物引起的急性肝功能衰竭占94. 8%。2007年， 由中华医学会消化病学分会肝胆疾病协作组牵头，第四军医大学西京医院消化科等19家 医院消化科参与开展的"全国多中心急性药物性肝损伤住院病历调查分析"研究。该研究 采用国际RUCAM评分系统，对我国急性药物性肝损伤的发病状况、临床征象及引起发病的 药物等进行了系统的分析。研究人员发现，我国急性药物性肝损伤发病呈逐年增加趋势，抗 结核药物、中成药或中草药可能是急性药物性肝损伤的主要诱因。临床上多种药物能够引 起急性肝功能衰竭，如：对乙酰氨基酚、曲格列酮（抗糖尿病药物）、抗结核病药物、海罗芬 类麻醉药、抗生素、非留醇类抗炎药物（溴芬酸）（苯噁丙酸）。
[0006] 目前临床上对于药物或其他诱因引起的急性肝功能衰竭，其诊断的方法也不同。 临床上对于急性肝功能的衰竭主要是通过临床症状来判断，如明显的不适，恶心，以及继发 的黄疸症症状等，然而一旦确诊黄疸是由药物引发的急性肝功能衰竭导致的，病人距离其 死亡就已经非常接近了。同时，仅仅通过身体的变化来判断是否是急性肝功能衰竭是不充 分的，很容易与革兰氏阴性菌引起的败血症或者瘾君子混淆。现在Hy'srule被用于预测 药物肝功能衰竭。即患者血液中谷丙转氨酶（以下简称ALT)的含量是正常范围上限的3 倍以上，胆红素为正常范围上限的2倍以上。然而，这种诊断方法还需要进一步的研究。一 方面ALT并不是在所有药物引起的急性肝功能衰竭中都是会上升的，如在罗格列酮引起的 急性肝功能衰竭中，ALT并不会显著上升；其次ALT发生显著性变化时，已为发病中期或后 期。因此，该检测方法在敏感程度和准确度方面都有待提高，常造成误诊或漏诊，尤其是在 两种或两种以上肝损伤类型交叉出现时，该缺点尤为突出。此外，酒精性肝病早期诊断都比 较困难，肝脏生物化学指标、影像学和组织病理学检查基本正常或轻微异常。综上所述，寻 找用于急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝病的早期预测诊断指标是非常紧迫的一项任务。
[0007] 酒精性肝损伤简称酒精肝，是遗传-环境-代谢应激相关性疾病。人体的肝脏除了 解毒外，还能降解和代谢吸收酒精，如果过量饮酒，酒精对肝细胞的毒性通过肝脏的代谢， 逐步造成对肝细胞的破坏，使肝细胞膜表面的脂质成分过度氧化，从而破坏了肝细胞膜，形 成酒精性肝损伤。酒精性肝损伤早期可无任何症状，但此时肝脏内部组织已发生了病理改 变。黄疸、肝肿大和压痛为酒精性肝炎病人的常见体征，有81%的病人出现肝肿大，77%的 病人有黄疸，转氨酶中度增高。据统计，全世界约有1500万~2000万人酗酒，这些人中有 10%~20% (150万~400万）有不同程度的酒精性肝损伤。山东大学附属齐鲁医院和泰 山医学院附属医院的马立宪等联合调查研究了7295个山东常住人口样本，结果发现624个 样本被诊断为酒精性脂肪肝，发病率达8. 55%。同时，酒精性脂肪肝的发病率与年龄，性别 职业，教育水平，家庭收入，婚姻状况等显著相关，酒精性脂肪肝在40-49岁，男性，高职位， 低家庭收入，低受教育水平以及未婚人群中发病率显著升高。此外一次性饮酒过量，亦可能 发生包括肝脏在内的多器官功能的衰竭。酒精性脂肪肝的常规诊断主要为AST(谷草转氨 酶），ALT，B超，CT等等。
[0008] 成纤维细胞生长因子21 (以下简称FGF21)由209个氨基酸所组成，其中N末端含 有一个由28个氨基酸残基组成的信号肽。人类FGF21基因坐落在19号染色体上，由3个 外显子组成。FGF21主要在肝脏、脂肪和胰腺中表达，此外，在骨骼肌、胸腺及内皮细胞中也 有所表达。近期的研究表明：FGF21具有内分泌因子的功能，参与机体物质代谢，维持机体 内糖脂代谢的平衡。FGF21基因在肝脏中的表达主要受到禁食和饱腹信号的影响。在禁食 状态下，通过激活过氧化物酶增殖体激活受体（PPARc〇和胰高血糖素刺激蛋白激酶（PKA) 的作用来上调FGF21基因的表达；而葡萄糖作为一种饱腹的信号作用，也会通过激活碳水 化合物反应元件结合蛋白（ChREBP)的作用来诱导肝脏中FGF21基因的表达。在脂肪细胞 中，PPARY和ChREBP在调节FGF21基因的表达有着重要的作用。然而，就FGF21与化学性、 药物性肝损伤以及酒精性肝病的研究而言，无论是动物还是临床方面，都知之甚少。
[0009] 在肝损伤早期能够对肝损伤进行积极治疗防止疾病的恶化和蔓延，对肝脏疾病来 说是十分重要的。因此，研究肝损伤更敏感、准确的标记物有重要的意义。F如血清检测 ALT、AST检查作为各型肝病必查的指标一样，FGF21是否能够作为诊断急性肝功能衰竭和 酒精性脂肪给的常用检查参数，对于这些疾病的预防和早期诊断具有重要的临床应用价 值。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的之一是提供急性肝功能衰竭与FGF21之间存在密切相关性的证据。
[0011] 为了达到上述目的，本发明模拟急性肝功能衰竭的病理机制，建立化学性和药物 性诱发的急性肝损伤模型：化学性--四氯化碳（CC14)引起的急性肝损伤；药物性一对 乙酰氨基酚（APAP)引起的急性肝损伤。上述模型的建立方法如下：
[0012] 1.四氯化碳（CC14)致急性肝功能衰竭模型：小鼠体重为20~25g，SPF环境饲养， 将CC14溶于橄榄油，按10mL/kg经小鼠腹腔注射，一次给予0. 125 %CC14溶液，12h后处死， 可建立小鼠肝损伤模型。
[0013] 2.对乙酰氨基酚（APAP)致急性肝功能衰竭模型：小鼠体重为20~25g，SPF环境 饲养，将对乙酰氨基酚溶于40°C无菌生理盐水，给小鼠500mg/kg-次性腹腔注射，24h后处 死，可建立小鼠肝损伤模型。
[0014] 为了提供二种急性肝功能衰竭与FGF21之间相关性的依据，本发明在建立小鼠急 性肝功能衰竭模型时，对12h(CC14致急性肝功能衰竭模型）或24h(APAP致急性肝功能衰 竭模型）内，小鼠血清中FGF21的浓度进行监测。同时，为客观评价FGF21在2种急性肝功 能衰竭模型中的变化，本发明检测了不同时间点肝脏组织中FGF21蛋白mRNA的表达水平。
[0015] 本发明的目的之一是提供一种新型的可用于且早于ALT和AST的急性肝功能衰竭 的诊断指标。
[0016] 为了达到上述目的，本发明评价FGF21作为急性肝功能衰竭早期诊断指标的优 势，本发明比较了其与目前临床上用于急性肝功能衰竭的诊断指标在疾病发生进程中，血 清和肝脏组织中发生显著性变化的时间点的先后。所述目前临床上诊断指标指ALT，AST。
[0017] 本发明的另一个目的是提供FGF21在急性肝功能衰竭小鼠模型中具有肝脏保护 的作用。