[0018] 为了达到检测FGF21在急性肝损伤过程中是否具有肝脏保护作用，本发明在对乙 酰氨基酚引起的急性肝损伤模型建模的同时，进行FGF21蛋白给药，并观察不同时间点血 清中，以及肝脏中ALT，AST和FGF21的含量或表达水平。同时，本发明通过肝组织切片，直 观地观测了在建立急性肝功能衰竭后24h后小鼠肝脏组织的损伤情况。
[0019] 本发明的另一个目的是提供酒精性脂肪肝与FGF21之间存在紧密型关系的依据。
[0020] 为了达到上述目的，本发明考察了酒精性脂肪肝患者和正常人群血清中FGF21的 水平。
[0021] 本发明共检测了 60例ALD患者（男29例/女31例）和50例（男26例/女24 例）年龄、性别相匹配的正常人群血清中的FGF21的水平，并比较分析了模型组样本与对 照组样本FGF21蛋白之间的差异。
[0022] 结合本发明研究结果，建议：
[0023] 1.将FGF21列入药物性和化学性急性肝功能衰竭的早期诊断指标。肝损伤诊断 时，采用以下标准：血清中FGF21含量异常升高时，判断其肝脏功能可能发生损伤，并建议 其做进一步的确诊。
[0024] 2.将FGF21列入临床上酒精性脂肪肝ALD辅助诊断指标，采用以下标准：人血 清中FGF21含量的正常值为167. 9±15. 6ng/L;如果血清中FGF21的含量达到或者超过 475. 5±47. 5ng/L，表明其有ALD的可能，但不作为确诊的唯一依据。
[0025] 3.将血清FGF21浓度作为长期酗酒，体质虚弱易感冒人群潜在肝损伤的常规诊断 指标。
[0026] 本发明的益处：
[0027] 1.本发明提供了将FGF21作为脂肪肝的辅助诊断指标的证据。在目前对于肝脏疾 病发病率呈逐年上升趋势的大背景下，本发明有利于提供急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝 的早期临床辅助性诊断指标。
[0028] 2.本发明提供了FGF21与2种急性肝功能衰竭之间的相关性证据，即四氯化碳和 对乙酰氨基酚引起的肝功能衰竭。在目前ALT作为急性肝功能衰竭诊断指标时具有反应滞 后，且存在实用性争议的情况下，将FGF21作为急性肝功能衰竭的辅助诊断指标，对于急性 肝功能衰竭的早期诊断具有重要的意义。
[0029] 3.本发明提供的生物标记物相比于目前常用的肝损伤诊断指标，具有早期诊断和 灵敏度高的优点。本发明符合临床上对于急性肝功能衰竭进行早期、特异性诊断的迫切需 求，可提供急性肝功能衰竭的早期诊断和病程干预。
[0030] 4.本发明提供了一种酒精性脂肪肝的预警指标，对于长期酗酒人群酒精性肝病的 及早发现和预防具有重要的意义。
【附图说明】
[0031] 图1注射生理盐水与四氯化碳（CC14) 12h后小鼠肝脏HE染色对照。
[0032] 图2四氯化碳（CC14)引起的小鼠急性肝功能衰竭模型中血清ALT，AST和FGF21的 变化情况。
[0033] 图3四氯化碳（CC14)引起的小鼠急性肝功能衰竭模型中肝脏FGF21基因表达的 时间变化。
[0034] 图4注射对乙酰氨基酚（APAP)后小鼠肝脏与正常小鼠肝脏HE染色对照。
[0035] 图5对乙酰氨基酚（APAP)弓丨起的肝损伤中FGF21、ALT、AST倍数变化情况。
[0036] 图6注射对乙酰氨基酚（APAP) 6h后相关组织FGF21的表达情况。
[0037] 图7注射对乙酰氨基酚（APAP)后，各时间点肝脏组织FGF21的表达情况。
[0038] 图8脂肪性肝病患者血清中循环FGF21水平变化情况。
[0039] 图9脂肪性肝病患者血清FGF21水平与甘油三酯代谢之间的关系。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1FGF21用于评价四氯化碳（CC14)所致小鼠发生的急性肝功能衰竭
[0041] 1.动物分组及药物处理安排
[0042] 取8周龄C57BL/6j小鼠20只，分为A组和B组，每组10只。A组小鼠按照10mL/ kg的剂量经腹腔一次性注射0. 125%CC14溶液，B组经腹腔注射等剂量的生理盐水作为对 照，分别在注射前（Oh)及注射后4h、6h、8h从尾静脉收集其血液样品，12h处死。另取8周 龄C57BL/6j小鼠25只，分为I、II、III、IV、V组，每组5只。每组小鼠按照上述剂量腹腔 注射CC14溶液，I组小鼠在CC14注射前（Oh)处死，II、III、IV、V组小鼠分别在注射后2h、 4h、6h、8h处死。
[0043] 2.动物组织样品收集
[0044] 将小鼠用10%水合氯醛麻醉，心脏取血收集血样标本，分离血清，用于检测FGF21 蛋白浓度变化以及谷丙转氨酶（ALT)和谷草转氨酶（AST)的活性变化；小鼠血样收集后， 依次打开腹腔和胸腔，用灭菌的PBS进行心脏灌流，除去血管及器官组织中的残留血液，然 后分离肝脏，将肝脏切分成几部分，一部分固定于4%多聚甲醛，制作成石蜡切片，用于进行 染色；剩余部分肝大叶和肝小叶冻存于液氮中，用于分离提取RNA样品。
[0045] 3?主要研究内容的具体实验方法
[0046] (1)血清FGF21ELISA检测
[0047] 收集的全血样品于3000Xg离心机4°C离心15min，取小鼠血清，采用Antibody andImmunoassayservices提供的mouseFGF21ELISA试剂，检测血清FGF21 水平。其具体 的检测步骤如下：
[0048]a)将标准品和稀释后的样品加入ELISA板中，每孔100iiL后室温辨育lh
[0049]b)弃去液体后洗板，每次lmin，共3次，最后一次弃去洗液
[0050] c)每孔加入100iiL的1X检测抗体，室温孵育lh
[0051]d)弃去液体后洗板，每次lmin，共3次，最后一次弃去洗液
[0052]e)加入100iiL辣根过氧化酶，室温孵育30min
[0053] f)弃去液体后洗板，每次lmin，共4次，最后一次弃去洗液
[0054]g)加入100UL底物后室温孵育15min
[0055] h)每孔加入100iiL终止液终止反应
[0056]i)读数，于450nm的酶标仪下读出所得的值 [0057]j)绘制标准曲线，计算各个样品的浓度
[0058] (2)血清ALT和AST检测
[0059]a)取上述实验所收集的小鼠血清，采用北京科美生物科技有限公司的ALT、AST试 剂盒，参考其试剂盒的说明书对迈瑞全自动生化仪进行参数设置。
[0060]
[0061] b)取50ul血液样品或稀释后样品进行检测，采用灭菌生理盐水进行稀释，其稀释 倍数在1 : 1-1 : 50的范围。
[0062]c)质控管理
[0063]d)定标管理：定标液管理：增加定标液（eg.H20,质控）；批号；浓度水平（正常）； 有效期；标准浓度输入；设置样本位（Sl，S2)
[0064] e)样品申请
[0065]f)定标结果查询
[0066] (3)肝脏组织固定、包埋和H&E染色：
[0067] ①肝脏组织固定、包埋：
[0068]a)固定：4% 甲酸8h
[0069] b)保存：75%乙醇过夜
[0070]c)脱水：依次按 80% 乙醇lh、95% 乙醇lh、95% 乙醇 45min、100% 乙醇 30min、 100%乙醇3〇1^11进行脱水
[0071]d)透明：二甲苯I、二甲苯II依次按顺序各放置15min
[0072]e)浸蜡：软蜡、硬蜡依次按顺序各放置1. 5h
[0073] 脱水后石蜡包埋后，采用石蜡切片机切成5pm厚度的组织肝脏切片，60°C烘烤半 小时待用，采用如下方法进行H&E染色。
[0074]②H&E染色：
[0075] 1)试液配置
[0076] 0. 25% -0. 5%水溶性伊红染液：0. 25-0. 5g水溶性伊红Y放入蒸馏水100ml溶解。
[0077] 苏木素：先将lg苏木精溶于10ml酒精中，另将20g钾明矾和200ml蒸馏水放入较 大的优质三角烧瓶中加温并搅拌，待全部溶解后，再放入苏木精酒精溶液。混合后煮沸1-2 分钟。然后改用小火加温，慢慢加入〇. 5g氧化汞，同时不停地搅拌使其充分氧化。当液体 变为深紫蓝色时，即迅速将三角烧瓶移入冷水中使之尽速冷却，室温静置数小时至一夜。用 前过滤，每l〇〇ml滤液内加入0. 5-lml冰醋酸，以增强其染色力，染色时间为3-15分钟。
[0078] 2)染色步骤
[0079]a)脱錯：二甲苯5minX2次
[0080]b)水化：100 %乙醇、90 %乙醇、80 %乙醇、70 %乙醇、ddH20按此顺序各放置5min
[0081] c)苏木素染色：将组织切片置于苏木素中3min后自来水下冲洗lOmin
[0082]d) 1 %盐酸酒精分化：组织切片分化3sec后置于自来水下冲洗lOmin
[0083]e)伊红染色：组织切片置于伊红溶液中lmin后自来水冲去多余的伊红
[0084]f)脱水：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇，按此顺序各放置5min
[0085]g)透明：将组织切片放于二甲苯中30min
[0086] h)封片：中性树脂封片
[0087] (4)肝脏组织QPCR检测FGF21mRNA
[0088] ①将存于液氮的各组小鼠肝脏组织取出，用经高压灭菌的手术剪刀剪取20_30mg 肝组织于干净的1.5mLEP管中，加lmLTrizol，使用电动匀浆器高速匀浆组织，匀浆完组织 放于冰上静置5min。
[0089] ②RNA抽取：各管中加入0. 2mL氯仿，盖紧EP管，上下颠倒混匀15s，室温静置 2-3min;将组织于低温超速离心机上4°C12000g离心15min;取出EP管，此时EP管分三层， 取上层液相于另备EP管中。
[0090] ③RNA沉淀：加0. 5mL异丙醇，室温静置lOmin(异丙醇是上层液体积的0. 6-1 倍），4°C12000g离心lOmin;弃上清