FGF21蛋白的小 鼠，其精神状态介于两者之间，精神状态较好。此外，在实施过程中，A组小鼠在6个时间点 均有不同程度的中毒现象，表现为精神萎靡、喜卧、蜷缩，严重的具有明显的行动迟缓的症 状。剖检可见，对照组B组小鼠肝脏光滑、有弹性、色泽红润；其他各时间点小鼠肝脏均有不 同程度的病变，试验组小鼠肝脏病变较明显，肝脏肿胀、片状出血、质软。同时对两组小鼠的 肝脏进行染色后可以发现，APAP处理后，小鼠肝脏形成了大面积的损伤，其黑色箭头所 指粉色部分为肝脏损伤区域，而生理盐水处理的对照组没有损伤状况，如附图4所示。
[0142] (2)APAP诱导肝损伤小鼠血清中FGF21变化水平要比ALT、AST变化更灵敏
[0143] 在本项目中，为了比较APAP诱导的小鼠急性肝损伤血清中FGF21的蛋白变化与 ALT、AST活性变化的灵敏度，申请人做了FGF21、ALT、AST三者在血清中的倍数变化图。如 附图5所示，申请人依次分别检测了小鼠腹腔注射APAP前（Oh)及注射后2h、4h、6h、8h、12h 的血清中的FGF21表达水平和ALT、AST的活性水平，以Oh的活性为基准，计算获得各时间 点AST、ALT和FGF21的活性的倍数关系。从图中可以看出，血清中AST的相对活性水平在 24h内持续始终处于较低水平；血清中ALT的相对活性水平在Oh~12h时间段也一直处于 低水平阶段，直到12h~24h时间段才发生急剧性上升；血清中FGF21的相对活性水平在 Oh~6h之间稳步上升，在6h时血清中的FGF21的相对活性达到峰值，而后在6h~24h又 逐步下降。本项目结果显示，同案例1注射CC14造成的肝损伤趋势类似，腹腔注射APAP造 成药物性肝损伤的小鼠血清中的ALT、AST在肝脏损伤发生的早期也因处于较低水平而无 法准确得对肝脏的早期病变情况作出诊断。而血清中的FGF21在损伤出现的早期即发生显 著性上升的，相对于血清中ALT、AST的活性变化具有更高的特异性和灵敏度，为肝损伤的 早期诊断提供了可行性。
[0144] (3)APAP处理6h后，FGF21在小鼠相关器官的表达差异
[0145] 根据图5所得出的结论，血清中FGF21的表达水平在6h时达到峰值。申请人为了 深入探究血清中表达上升的FGF21的主要来源，在APAP注射6h后，分别取注射APAP的实 验组小鼠具有合成分泌FGF21的相关器官或组织，以注射等剂量生理盐水的小鼠为对照。 对组织中的FGF21mRNA的表达进行检测。结果如附图6所示，申请人采用QPCR技术分别 检测实验组和对照组小鼠的胰脏、心脏、肾脏、白色脂肪、肌肉、褐色脂肪以及肝脏组织中的 FGF2ImRNA的表达情况。从图中可以看出，APAP处理后，肝脏中的FGF2ImRNA的表达倍数显 著性上升，差异具有统计学意义；且APAP处理后，小鼠肝脏中FGF21mRNA的相对表达量与 其它组织器官中FGF2ImRNA的相对表达量相比，腹腔注射了APAP的小鼠肝脏中FGF2ImRNA 的相对表达量均比其它组织器官显著性上升。该结果说明血清中FGF21的表达水平明显升 高，主要是由于FGF21在肝脏大量表达分泌入血所引起的。
[0146] (4)APAP处理后不同时间点，肝脏中FGF21mRNA的表达量显著上升
[0147] 在本项目中，申请者为了进一步探究经APAP处理后肝脏FGF21在不同时间点的表 达情况，对注射APAP前（Oh)及注射后2h、4h、6h、8h、12h各组小鼠肝脏FGF2ImRNA进行QPCR 检测。如附图7所示，以注射APAP前（Oh)肝脏中FGF21mRNA的表达量为基准，注射APAP2h、 4h、6h、8h、12h后各组小鼠肝脏FGF2ImRNA相对表达量随时间的变化关系。从图中可以看 出，注射APAP后Oh~4h小鼠肝脏FGF21mRNA的表达量急剧上升，4h时达到表达量的峰值， 而后4h~12h时间段又缓慢下降。说明腹腔注射APAP可引起小鼠肝脏中的FGF21mRNA的 表达量发生显著性上升。
[0148] 实施例3FGF21在酒精性脂肪性肝病（ALD)患者中的临床表现
[0149] 1.ALD临床病例收集和临床分析方法
[0150] (1)临床诊断标准
[0151] 根据我国现行的ALD临床诊断标准将酒精性脂肪肝患者列为研究对象。具体的诊 断标准如下：①无饮酒史或饮酒折合乙醇量男性每周140克，女性70克；②排除病毒性肝 炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定疾病。③除原发疾病 临床表现外，有乏力、消化不良、肝区隐痛、肝脾肿大等非特异性症状及体征。④可有超重/ 内脏性肥胖、空腹血糖增高、血脂紊乱、高血压等代谢综合征。⑤血清谷丙转氨酶和谷草转 氨酶水平可由轻至中度增高，通常以谷丙转氨酶升高为主⑥肝脏影像学表现符合弥漫性脂 肪肝的影像学诊断标准⑦肝活检组织学改变符合脂肪性肝病的病理学诊断标准。凡具备上 述第①~⑤项和第⑥或第⑦项中任何一项者即可诊断为脂肪肝。
[0152] (2)病例收集
[0153] 根据上述的临床诊断标准，60例ALD患者（男29例/女31例）被收入本项目的 研究工作。与此同时，50例（男25例/女24例）年龄、性别相匹配的正常人群被收录为 本项目研究的对照组。所有入选本项目研究的人群入选前均由同一肝胆内科医生进行问 卷调查以及临床生化检查，对有心血管疾病、高血压和糖尿病等相关疾病病史的人群，以及 以前使用过降脂、抗高血压或是治疗糖尿病药物的ALD患者均不能入选为本项目的研究对 象。此外，所有入选对象包括ALD患者和正常对照人群都签署了书面知情同意书，所有的程 序均由温州医科大学伦理委员会批准。
[0154] (3)临床资料收集及生化检测
[0155] 对所有受试者进行相关临床问卷调查评估后，过夜禁食10h，收集血样标本， 分离血清标本，-8〇°C冷冻保持。机体指数检测（身高、体重、身体质量指数、腰围和血 压）和生化指标参照前的研究报道的方式进行。血清中FGF21(ELISAkit，Biovendor， Modrice，CzechRepublic)根据商业试剂公司提供的说明书进行检测；在经过认证的临床 检验实验室，对空腹血糖、总胆固醇、商密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A1 (ApoAl)、载脂蛋白 BlOO(ApoBlOO)、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯进行检测。
[0156] (4)统计学分析
[0157] 本项目所有分析均采用统计学软件13. 0版本（SPSS，Chicago,IL)根据以前报道 的临床研究方式进行统计分析。简单来说，正态分布数据通常用mean±SD描述。非正态分 布的数据用Kolmogorox-Smimov检验，分析前进行对数转换，用四分位距表示中位数。采用 Student's成组t检验进行组间比较。用Pearson's相关性校正组间差异，并用Bonferroni 校正多个检验结果。用多元回归分析方法分析血清中FGF21与其它临床指标、生化指标等 参数之间的关联性。变量与血清FGF21呈显著性相关（用Bonferroni校正多个检验）的 参数进入多元回归分析。在所有统计检验结果中，P< 0. 05被认为具有统计学意义。
[0158] 2.案例结果
[0159] (1)脂肪性肝病患者血清中循环FGF21水平显著升高
[0160] ALD患者和健康对照组的生化指标及临床特征如表1所示。110例参与者的血清 FGF21水平无性别差异。以身体质量指数（BMI)校正后的（表1和图8)统计分析结果显示， 与对照组FGF21水平（167. 9±15. 6ng/L)相比较，ALD患者血清FGF21水平（475. 5±47. 5) 显著高出2. 5倍（P< 0? 0001)。
[0161] 表1ALD患者与正常对照人群的一般临床资料
[0162]
[0163] 注：SBP:收缩压；DBP:舒张压
[0164] (2)血清FGF21水平与甘油三酯代谢之间的关系
[0165] 申请人随机在上述ALD患者病例和健康对照组中各选取17例（男8例/女9例）， 对患者的血清FGF21和肝脏的甘油三酯的相关性进行分析。如图9所示，根据血清FGF21 和肝脏的甘油三酯的表达水平绘制散点图，构建直线回归方程。回归方程的相关系数r分 别为0. 662和0. 692,表明血清FGF21和肝脏的甘油三酯均存在着正相关性，具有统计学意 义。
【主权项】
1. 成纤维细胞生长因子21(以下简称FGF21)作为急性肝功能衰竭的早期辅助诊断指 标。其特征在于，所述急性肝功能衰竭指由四氯化碳和对乙酰氨基酚（APAP)引起的急性肝 功能衰竭；血清中FGF21在急性肝功能衰竭过程中的变化要早于临床上现行的诊断指标， 即谷丙转氨酶和谷草转氨酶；FGF21作为急性肝功能衰竭的其诊断依据为血清中FGF21蛋 白异常升商。2. 重组人FGF21作为治疗和保护由对乙酰氨基酚（APAP)引起的急性肝功能衰竭的药 物。其特征在于，重组人FGF21能够保护肝脏组织受APAP的损伤。3. 将FGF21列入临床上酒精性脂肪肝（ALD)辅助诊断指标，采用以下标准：人血 清中FGF21含量的正常值为167.9±15.6ng/L;如果血清中FGF21的含量达到或者超过 475. 5±47. 5ng/L，表明其有ALD的可能，但不作为确诊的唯一依据。4. 将血清FGF21浓度作为长期酗酒，体质虚弱易感冒人群潜在肝损伤的常规诊断指 标。
【专利摘要】本发明公开了一种可用于化学性和药物性引起的急性肝功能衰竭的早期诊断指标，以及酒精性脂肪肝病的诊断指标——成纤维细胞生长因子21(以下简称FGF21)。急性肝功能衰竭的病程较快，迫切需要一个能够进行早期诊断的指标。本发明提供的FGF21诊断指标具有比目前现行的谷丙转氨酶和谷草转氨酶更加敏感的特点。同时本发明发现重组人FGF21能够保护肝组织受对乙酰氨基酚的损伤。综上所述，本发明具有良好的临床应用价值。
【IPC分类】A61P1/16, A61K38/18
【公开号】CN105214069
【申请号】CN201410249772
【发明人】林灼锋, 潘薛波, 吴帆, 李校堃, 金雷钢, 施立华, 邵怡辉, 张赛赛
【申请人】温州医科大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年6月4日