一种食蟹猴酒精性肝病模型的构建方法与流程

本发明属于动物模型的构建方法，具体涉及到一种食蟹猴酒精性肝病模型的构建方法。

背景技术：

随着我国经济的高速发展，居民酒精的消费也不断增加，与饮酒相关的问题也越来越突出。正常人在24小时体内可代谢120g乙醇，但长期、过量地饮酒会超过机体的代谢能力，可导致酒精性肝病。该病的发生主要是乙醇及其代谢物-乙醛的毒性作用造成的，尤其是乙醛对肝细胞的毒性作用最明显，二者直接或间接导致肝脏的系列病变：肝细胞变性(酒精性脂肪肝)、坏死(肝炎)、纤维化(肝纤维化)，严重时可发展为肝硬化、肝癌。

临床上，酒精性肝病的治疗上缺乏有针对性的靶点治疗方法，临床上只能被动的以对症处理为主(用营养支持来防治营养不良和用糖皮质激素来控制炎症)。

因此，建立一种更接近人类酒精性肝病的动物模型，尤其是构建具有酒精性肝脏病变进程的动物模型，利用该动物模型研究其发生机制，进而发现新的治疗靶点和药物，是具有非常重要的医学基础理论和临床应用价值。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种酒精性肝病动物模型的构建方法，该方法的特点是在构建动物模型的过程，逐渐实现酒精性肝脏病变的过程(包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性纤维化等)。

本发明所提供的技术方案是：

一种酒精性肝病动物模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)选取雄性8-10kg的食蟹猴作为研究对象，除正常喂养基础饲料外，在第1周适应阶段让其自行饮用含有阿斯巴甜的饮用水，从第2周开始在饮用水中按每周增加10％的酒精让其自由饮用，到第4周末筛选出每日饮用30％酒精超过50mL的食蟹猴作为试验动物；

(2)从第5周开始用10％蔗糖代替酒精溶液中的阿斯巴甜，除继续喂养30％酒精外，在基础饲料中额外添加20％的猪板油；

(3)酒精性脂肪肝模型的建立：在使用高糖、高脂饲料喂养，30％酒精自由饮用条件下，饲养第12周末①，经B超诱导进行肝脏活检，肝组织用HE染色，食蟹猴表现明显的脂肪肝症状；

(4)酒精性肝炎、肝纤维化模型的建立：在①的基础上，继续使用高糖、高脂饲料喂养，30％酒精自由饮用条件，并且腹腔注射四氯化碳溶液，每周2次，每次注射量为0.25mL/kg；第16周末，经B超诱导进行肝脏活检，肝组织用HE染色，食蟹猴表现明显的肝细胞膜破裂、浸润的肝炎症状；第24周末，经B超诱导进行肝脏活检，肝组织用HE染色，食蟹猴表现明显的肝纤维化症状。

作为优选，步骤(1)中所述的含有阿斯巴甜的饮用水中阿斯巴甜的质量百分比为0.1-1％。

作为优选，所述的含有阿斯巴甜的饮用水中阿斯巴甜的质量百分比为0.5％。

作为优选，步骤(1)中所述的基础饲料为蛋白质15-20％，碳水化合物50-60％，脂肪5％，粗纤维4-6％，其它9-26％。

作为优选，步骤(4)中所述的高糖、高脂饲料是在基础饲料基础上，糖分由3％升至8-10％，脂肪由5％升至20-25％。

作为优选，步骤(4)中所述的四氯化碳溶液为将四氯化碳分散在橄榄油中，其含量为10％v/v。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的食蟹猴酒精性肝病模型的构建方法时间短，成功率高，可以用于研究酒精性肝病的发生机理，便于筛选治疗酒精性肝病的药物以及评价药物对该酒精性肝病的药效，具有良好的应用前景。

(2)动物有厌恶酒精的天性，故在第1周通过甜味剂的引诱，促使食蟹猴能主动摄食乙醇。为了避免部分甜味剂对肝损的保护作用(如蔗糖、葡萄糖等能提供肝线粒体能量，罗汉果甜苷、甜菊苷等能避免肝细胞的损伤)，造模初期优选阿斯巴甜为甜味剂，这样既能引诱食蟹猴主动摄食酒精，又可避免对肝细胞的保护作用。

(3)酒精性肝病的发生主要是乙醇及其代谢物-乙醛的毒性作用所致，尤其是乙醛对肝细胞的影响是多方面的：影响线粒体对三磷酸腺苷(ATP)的产生、蛋白质的生物合成和排泄受阻、微管损伤，使蛋白、脂肪排泄障碍而在肝细胞内蓄积。而在影响肝细胞的初期，蔗糖、葡萄糖、脂肪、蛋白质等能对抗肝细胞的损失。酒精性脂肪肝模型是在前期通过酒精引起轻度肝损的前提下，加大饲料中糖份、脂肪的比例，从而加重肝脏的负担，促使脂肪在肝细胞内快速蓄积，形成脂肪肝。

(4)单纯酒精+高糖、高脂肪喂养大多数情况下只能诱发脂肪变性，要想达到更严重的肝损伤(如肝炎、肝纤维化等)，往往需要第二波打击，即二次损伤。第二波打击的方式有很多，包括药物因素、激素、肝药酶诱导剂、基因操作和病毒感染等。本发明优选四氯化碳为第二波打击的手段，因为四氯化碳在肝脏代谢后能快速增强脂质过氧化，引起肝细胞内质网、线粒体、高尔基体甚至细胞膜的变性和坏死，形成肝炎，后期更容易引起肝纤维化。

附图说明

附图1为食蟹猴表现明显的脂肪肝症状；

附图2为食蟹猴表现明显的肝炎症状；

附图3为食蟹猴表现明显的肝纤维化症状。

具体实施方式

下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。

一种酒精性肝病动物模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)选取雄性8-10kg的食蟹猴作为研究对象，除正常喂养基础饲料外，在第1周适应阶段让其自行饮用含有阿斯巴甜的饮用水，从第2周开始在饮用水中按每周增加10％的食用乙醇任其自由饮用，到第4周末筛选出每日饮用30％酒精超过50ml的食蟹猴作为试验动物；所述的含有阿斯巴甜的饮用水中阿斯巴甜的质量百分比为0.1-1％；所述的基础饲料为蛋白质15-20％，碳水化合物50-60％，脂肪5％，粗纤维4-6％，其它9-26％；

(2)从第5周开始用10％蔗糖代替酒精溶液中的阿斯巴甜，除继续喂养30％酒精外，在基础饲料中额外添加20％的猪板油；

(3)酒精性脂肪肝模型的建立：在使用高糖、高脂饲料喂养，30％酒精自由饮用条件下，饲养第12周末①，经B超诱导进行肝脏活检，肝组织用HE染色，食蟹猴表现明显的脂肪肝症状，参见图1；所述的高糖、高脂饲料是在基础饲料基础上，糖分由3％升至8-10％，脂肪由5％升至20-25％；

(4)酒精性肝炎、肝纤维化模型的建立：在①的基础上，继续使用高糖、高脂饲料喂养，30％酒精自由饮用条件，并且腹腔注射四氯化碳溶液，每周2次，每次注射量为0.25mL/kg；第16周末，经B超诱导进行肝脏活检，肝组织用HE染色，食蟹猴表现明显的肝细胞膜破裂、浸润的肝炎症状，参见图2；第24周末，经B超诱导进行肝脏活检，肝组织用HE染色，食蟹猴表现明显的肝纤维化症状，参见图3；所述的四氯化碳溶液为将四氯化碳分散在橄榄油中，其含量为10％v/v。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。