成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备肝纤维化治疗药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及成纤维细胞生长因子-21成熟肽的一种新用途，即成纤维细胞生长因 子-21成熟肽在制备肝纤维化治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外间质 成分（ECM)过度异常地沉积，从而影响肝脏的功能，是慢性肝损伤共有的病理反应，最终将 导致肝硬化、门静脉高压症、肝衰竭和肝细胞癌等。
[0003] 肝纤维化的病因很多，如乙肝病毒感染、脂肪肝、长期饮酒及药物等长期持续损害 肝脏，都将导致肝纤维化形成。在这些肝纤维化的诱因中，单纯乙肝患者就已经超过2500 万，而脂肪肝的发病率更高，2013年的统计表明北京地区脂肪肝的发病率为13%，这些疾 病最终都可能发展成为肝纤维化，所以肝纤维化的发病率非常高，治疗肝纤维化的药物市 场十分巨大。
[0004] 目前尚没有治疗肝纤维化的理想药物，正如著名肝脏病学家Hans Popper所 说："谁能阻止或减缓肝纤维化的发生，谁就将会治愈大多数慢性肝病"。因此，研究治疗肝 纤维化的药物成为全世界医药工作者的竞争的焦点之一。
[0005] 肝星状细胞（HSC)是肝内一种具有多功能、变化不定的非实质细胞，HSC活化是 肝纤维化发生的中心环节。研究证实，HSC是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤 维细胞样细胞，进而导致肝纤维化。HSC活化分启动与持续2个阶段。启动主要依赖旁 分泌机制，肝损伤后造成肝细胞凋亡，凋亡小体激活库普弗细胞与血小板分泌转化生长因 子-β (TGF-β)、血小板衍生生长因子（PDGF)等细胞因子、趋化因子，同时受损肝细胞与内 皮细胞释放各种HSC刺激因子（如成纤维细胞因子、TGF-β、IGF-1、TNF-α、IL-1、IL-6)， 共同介导HSC被激活并转化为肌纤维母细胞，肌纤维母细胞可以自分泌TGF- β等因子，进 而导致ECM过度沉积和纤维化。其中，HSC激活过程中，TGF-β、TOGF以及TNF-a、IL-1、 IL-6等炎症因子起关键作用。因此，抑制TGF- β、PDGF表达和抑制炎症反应是治疗肝纤维 化的关键靶点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备肝纤维化治疗 和/或预防药物中的应用。
[0007] 本发明还保护一种治疗和/或预防肝纤维化的药物，其活性成分为成纤维细胞生 长因子-21成熟肽。所述药物还包括其它药学上可接受的载体或辅料。所述药物中，除了 所述活性成分外，可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载 体、增效剂和添加剂等。所述药物的给药形态可为针剂（如粉剂、水剂、油剂）。所述制剂都 可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法而获得。所述药物的给药途径可为皮下注射、 静脉注射或肌肉注射。
[0008] 以上任一所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽为如下（a)或（b):
[0009] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有治疗和/或预防肝纤维化的功能的由序列1衍生的蛋白质。
[0011] 所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽对肝纤维化的治疗作用体现为（c 1)至（c8) 中的至少一种：
[0012] (cl)抑制肝纤维化程度；
[0013] (c2)抑制肝纤维化发生；
[0014] (c3)降低肝脏中胶原纤维和/或肌纤维的水平；
[0015] (c4)降低肝脏中羟脯氨酸的水平；
[0016] (c5)降低肝脏中I型胶原蛋白和/或α-平滑肌肌动蛋白的水平；
[0017] (c6)降低肝脏中IL-6和/或TNF- α和/或IL-1 β的水平；
[0018] (c7)降低血液中IL-6和/或TNF- α和/或IL-1 β的水平；
[0019] (c8)降低肝脏中TGF-β和/或磷酸化Smad2/3的水平。
[0020] 以上任一所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽具体可采用包括如下步骤的方法 制备：
[0021] (1)表达所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽与分子伴侣的融合蛋白；
[0022] (2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侣后得到所述成纤维细胞生长因子-21 成熟肽。
[0023] 所述分子伴侣具体可为分子泛素样修饰蛋白（即分子伴侣SUM0)。
[0024] 所述"表达所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽与分子伴侣的融合蛋白"的实现 方法如下：将所述成纤维细胞生长因子-21的编码基因插入原核表达载体pSUMO,得到重组 质粒；将所述重组质粒导入大肠杆菌Rosetta (DE3)，得到重组菌；发酵所述重组菌并采用 IPTG进行诱导，得到所述融合蛋白。
[0025] 所述"切除所述分子伴侣"的实现方式如下：取所述融合蛋白，用SUM0蛋白酶 I (SUM0蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比具体可为1:50)和DTT (所述DTT的初始浓度可为 2mmol/L)切割（切割条件具体可为4°C切割过夜）。
[0026] 所述成纤维细胞生长因子-21成熟肽的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的 DNA分子：
[0027] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0028] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分 子；
[0029] 3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA 分子。
[0030] 所述严格条件为在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂 交并洗膜。
[0031] 本发明发现成纤维细胞生长因子-21成熟肽能够有效抑制肝纤维化的发生，可作 为药物治疗和/或预防肝纤维化，对于肝纤维化的治疗和预防具有重大价值。
【附图说明】
[0032] 图1为FGF-21成熟肽溶液的聚丙烯凝胶电泳图。
[0033] 图2为HE染色和Masson染色结果。
[0034] 图3为Masson染色的表面密度。
[0035] 图4为羟脯氨酸含量结果。
[0036] 图5为I型胶原蛋白基因和α -平滑肌肌动蛋白基因的表达水平，I型胶原蛋白 和α -平滑肌肌动蛋白相对β -actin蛋白的蛋白水平。
[0037] 图6为IL-6基因、TNF-α基因和IL-Ιβ基因的表达水平，IL-6、TNF_a和IL-Ιβ 含量。
[0038] 图7为TGF-β基因的表达水平，TGF-β蛋白相对β -actin蛋白的蛋白水平和磷 酸化Smad2/3蛋白相对Smad2/3蛋白的蛋白水平。
[0039] 图8为pIKB相对IKB的蛋白水平和NF-KB p65相对Lamin-bl的蛋白水平。
【具体实施方式】
[0040] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0041] FGF-21蛋白的成熟肽，简称FGF-21成熟肽，如序列表的序列1所示。FGF-21成熟 肽的编码基因如序列表的序列2所示。
[0042] 原核表达载体pSUMO(在文献中被称为"pHisSUMO"）：参考文献：姜媛媛，尹成凯， 李晋南，任桂萍，张薇，李德山.利用SUM0融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东 北农业大学学报，2008, 39(10) :57-62 ;李璐，尹成凯，李德山.高效表达可溶性重组蛋白 表达载体--pHisSUMO.生物技术，2009, 19(3) : 11-14.。
[0043] 大肠杆菌Rosetta (DE3):北京全式金生物技术有限公司，目录号CD801。
[0044] 雄性昆明小鼠：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心。
[0045] 二甲基亚硝胺：Sigma_Aldrich 公司；CAS 号 62-75-9。
[0046] 羟脯氨酸测定试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；产品编号A030-2。
[0047] PBS缓冲液（pH 7. 2):溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 137mmol/L， KC12. 7mmol/L, Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/L〇
[0048]