射流装置的制造方法
【专利说明】射流装置
[0001]相关申请
[0002]本案要求2012年10月23日(23/10/2012)提交的GB 1219014.6的优先权和权益，该申请的内容通过弓I用以其全部内容结合在此。
技术领域
[0003]本发明涉及用于分析组分混合物如多肽混合物的流动扩散方法和流动仪器。
【背景技术】
[0004]基本上重要或技术上重要的很多系统作为多种异质组分的多分散混合物存在。在此类混合物中个别组分的固有特性的说明在从分析化学到生物物理学范围的领域内是一个决定性问题。
[0005]异质颗粒混合物中的颗粒大小测量在由药物延伸的领域中是一个常见的问题，其中大小测量判断治疗剂到颜料、油墨和涂料的溶解性和纯度，所有这些的纳米和微尺度组分的大小必须受到严密地控制和监控以确保所希望的功能。
[0006]其中微尺度组分的大小是特别重要的并且具有大的定义重要性的领域是蛋白质缔合和自组装的领域；绝大部分蛋白质不是作为单体物质而是作为较大功能性复合物的一部分来实践其生物功能；如果没有出现以希望的方式将蛋白质组装成此类复合物而是形成异常物质，则此异常组装频繁地导致机能障碍和疾病。通常用于测量多肽大小的现有生物物理学技术表现最好以用于均质制备纯化的组分，而具有很多生物系统特征的均质混合物的定量研宄仍具有挑战性。
[0007]基于现有微流体扩散的定量技术[I]主要涉及发现均质溶液[5]中的一种单一物质的大小或者典型地使用荧光标记的物质[8、7、3、11、12、19]测量两种分离的物质之间的相互作用。还报道了不需要荧光标记样品的技术[4]。
[0008]例如，耶格尔(Yager)等人[11]描述了一种用于光学测量微通道中的横向分子扩散的T-传感器。该T-传感器具有两个输入端口，通过这些端口提供一个含分析物流体和一个缓冲液流体。两个流体物流在T型接头处接触并且被允许沿着一个检测通道并排地流动。在这些流沿着该通道行进时，分析物从分析物流体扩散到缓冲液流体中。作者使用若干种荧光标记蛋白质作为测试分析物，并且这些蛋白质的扩散是通过在该接头下游的一个测量位置处进行荧光显微镜检查来检测的。所述的方法集中于单分散分析物溶液的分析。
[0009]耶格尔等人注意到由所记录的实验扩散数据计算的扩散系数值包括误差，该误差涉及在计算中这些流体在整个检测通道中具有一个充分展开的速度曲线的假设。这个假设是不正确的，如作者所解释的。实际上，观察到流体的速率沿着该通道从这些流体首先接触的停滞点(在该接头处的零级流动区域)开始加快到也在下游一个点处充分展开的速率。为了补偿较缓慢的流体流动的此区域，作者描述了解释并定量流动发展的计算方法。作者自己承认，这些溶液的数值计算是粗糙的，缓慢计算(约I天的计算时间)，并且仅可以给出关于在所谓流动发展区域中扩散效应大小的意见。由此，由记录的数据计算的扩散系数不能适当地补偿在T型接头处的流体停滞。
[0010]US 2006/263903描述了加号(+)形状的微通道网络测定一种样品溶质的分子量和扩散率的用途。在此，一个单一分析物流体流在一个交叉点与一个单一空白流体流接触。这些流随后分离，其中每个流在一个单独的出口通道中离开该接触区域。对于一个范围的不同分析物和空白流体流速，测定已分散到接触区域中的空白流体流中的分析物的量。分析物的扩散率和分子量是通过比较所记录的扩散曲线与由标准分子的扩散生成的一个扩散率曲线数据组来测定的。所述的方法集中于单分散分析物溶液的分析。
[0011]本领域还已知用于基于一个流体通道中的一种物质的泰勒(Taylor)分散确定扩散特征的替代性射流方法。例如，US 2011/264380描述了用于测定多分散物质的流体动力学半径的方法。将有待分析的物质与一个单分散标准混合。将所得的混合物添加到沿着一个毛细管流动的一个载体流体中并且在该混合物排出该毛细管时记录它的泰勒曲线。
[0012]如US 2011/284380所注意到的，泰勒分散方法不适用于多分散混合物，因为所获得的结果简单地是一个平均信号，该平均信号反映了该混合物的全局特征而不是该混合物中每种组分的单个贡献。US 2011/264380通过使用一种多分散样品内的一个内部标准来部分解决这一点，该标准提供了对该平均信号的一个已知贡献。例如，在分析一种多分散聚合物产品的情况下，可以存在一种单体前体的一种内部标准。然后可以推导出多分散物质对于总体信号的贡献，并且可以测定多分散物质的平均流体动力学半径。然而，此方法仅可以提供一种多分散混合物的平均流体动力学半径。此外，基于泰勒分散的方法需要一个扩散的时间分辨的测量，这与通过耶格尔等人[11]描述的稳态方法相比典型地具有一个更低的敏感度。
[0013]本发明人已开发了考虑到在流动通道中分析组分扩散的这些问题的分析方法。
【发明内容】
[0014]本发明大体上提供了一种用于测定一种组分、包括一种多分散组分混合物的扩散系数的方法。具体地说，该方法可用于测定在一种混合物中的一种组分、优选地两种或更多种组分的流体动力学半径。本发明方法特别适用于分析聚合物混合物如蛋白质混合物。还提供了一种用于分析方法中的射流装置。
[0015]本发明的方法和装置可用于以比现存方法提高的准确度测定一种组分的扩散系数和流体动力学半径。在一些方面，本发明的方法和装置解决了在一个微型通道中的流体停滞的问题并且使得从停滞点延伸的流体发展区域最小化，从而允许在一个减小的时间内形成一个稳定流。
[0016]本发明的方法允许有待随着时间测量的一种或多种组分的扩散。以这种方式，该方法可以用于研宄这些流体的组成变化，并且更具体地说用于研宄一种组分以另一种相同组分或一种不同的组分的相互作用。例如，本发明可以用于监控这些流体中的组分的聚集，如多肽的聚集。一种混合物随着时间的扩散曲线变化可以用于进行组分聚集物的生成和分离。
[0017]使用扩散方法的另一个一般优点是研宄天然状态下的生物分子如蛋白质的机会。
[0018]在本发明的一个第一方面，提供了一种用于测定一种或多种组分的扩散系数的方法，该方法包括以下步骤:
[0019](i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；
[0020](ii)提供一个空白流体流；
[0021](iii)在一个大横截面通道中使该流(i)与该流(ii)接触，从而生成两个层流；
[0022](iv)允许在(iii)中生成的这些层流从该大横截面通道中流入一个小横截面通道中；
[0023](V)在该小横截面通道中测量该一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。
[0024]在一个实施例中，在该方法中的步骤(i)提供一种包含一种或多种组分的组分流体流。
[0025]在一个实施例中，该组分流体流和该空白流体流是水流。
[0026]在一个实施例中，在步骤(ii)中提供两个空白流，并且这些空白流被提供在大横截面通道的组分流的一侧，从而在步骤(iii)中在大横截面通道中生成三个层流。
[0027]在本发明的一个第二方面，提供了一种用于本发明的第一方面的方法中的射流装置，该装置包括与两个上游供应通道流体连通的一个大横截面通道和与大横截面通道流体连通的一个下游小横截面通道。
[0028]在本发明的第一方面的方法中，这些供应通道可以被提供用于一个组分流体流和一个空白流体流。射流装置被适配为用于检测流体流中的一种或多种组分的一种分析装置。该分析装置用于测量一种或多种组分在一个小横截面通道中的扩散。
[0029]在一个流体中存在多于一种组分的情况下，在此所述的方法允许测定每个组分的扩散系数，而不是组分混合物的一个平均扩散系数。记录的扩散曲线的去卷积可以通过在不同扩散时间记录多个扩散曲线，这具有减小记录的数据的噪音水平的益处。
[0030]在本发明的一个第三方面，提供了一种用于测定一种或多种组分的扩散系数的方法，该方法包括以下步骤:
[0031](i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；
[0032](ii)提供一个空白流体流；
[0033](iii)在一个通道中使该流⑴与该流(ii)接触，从而生成两个层流；
[0034](iv)在多个扩散时间，例如在三个或更多个扩散时间测量该一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。
[0035]提到多个扩散时间是提到在沿着流动通道的不同位置记录的径向扩散测量。因此，一个第二测量点可以位于一个第一测量点的通道下游。另外的测量点可以位于也沿着该通道下游的位置。
[0036]在一个实施例中，在该方法中的步骤(i)提供一种包含一种或多种组分的组分流体流。因此，步骤(iv)包括在多个扩散时间测量两种或更多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。
[0037]在一个实施例中，该组分流体流和该空白流体流是水流。
[0038]在一个实施例中，在步骤(ii)中提供两个空白流，并且这些空白流被提供在大横截面通道的组分流的一侧，从而在步骤(iii)中在大横截面通道中生成三个层流。
[0039]在一个实施例中，该方法进一步包括步骤(V)，其中一种组分的一个扩散系数值是由步骤(iv)的径向扩散测量值确定的，并且任选地流体动力学半径是由扩散系数值确定的。
[0040]在一个实施方案中，步骤(V)包括比较来自步骤(iv)的一种或多种组分的测量的径向扩散曲线与具有已知流体动力学半径的组分的一系列分布，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。
[0041]在一个实施方案中，步骤(V)包括使用关于具有已知流体动力学半径的组分的一系列分布的一种最高熵正规化方法，使来自步骤(iV)的一种或多种组分的测量的径向扩散曲线去卷积，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。在此实施例中，可以使用一种最小平方分析。具有已知流体动力学半径的组分的该系列分布可以是一系列预测的分布。
[0042]在本发明的另一个方面，提供了一种确定包含多种组分的一个流体的组成的方法，该方法包括以下步骤:
[0043](i)提供包含该多种组分的该流体的一个或多个测量的扩散曲线；
[0044](ii)提供具有已知流体动力学半径的组分的一系列预测的分布；以及
[0045](iii)使用关于具有已知流体动力学半径的组分的该系列分布的一种最高熵正规化方法，使该一种或多种组分的测量的径向扩散曲线去卷积，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。
[0046]在一个实施例中，确定一个流体的组成的方法提供基于该流体中每种组分的流体动力学半径的一个组成曲线。
[0047]在步骤(i)中的测量的扩散曲线可以是通过根据本发明的第一方面或第三方面的一种方法获得或可获得的。
[0048]在本发明的另一个方面，提供了一种用于分析包含一种或多种组分的一个流体中的组成改变的方法，该方法包括以下步骤:在一个第一时间从该流体中获取一种第一样品并且根据本发明的第一方面或第三方面进行一个分析，从而确定该流体在该第一时间的组成；以及在该第一时间之后的一个第二时间从该流体获取一个第二样品并且根据本发明的第一方面或第三方面进行一个分析，从而确定该流体在该第二时间的组成。
[0049]该方法可以包括在随后的时间获取另外的、如第三样品和第四样品并且根据第一方面或第三方面进行一个分析。
[0050]该方法允许生成有待检测的组分的聚集物并且允许分离有待检测的组分。反应速度可以是由这些结果确定。
[0051]本发明的其他方面和本发明的不同实施例为如在此所述的。
【附图说明】
[0052]图1a是根据应用的本发明的一个实施例的一个射流装置的一部分的示意图，其中图像显示在喷嘴处的一个组分流体流的分布(在此情况下，是牛血清白蛋白和β乳球蛋白在水中的混合物)和在沿着测量通道(小横截面通道)的和9_处的三个测量区域。空白流(黑色)被提供在组分流(白色)的一侧。
[0053]图1b是图1b的示意图的平面图。
[0054]图2包括涉及使用具有25nm和10nm半径的荧光标记组分(胶质)的一种50:50混合物(按体积计是0.1% )校准图1的射流装置的图表。A:径谱通过使用最大熵正规化记录的分布数据的一种最小平方分析(底部光谱)生成，并且与这些胶质中每一种的均质溶液的径谱(顶部光谱和从顶部光谱起的第二个光谱)相比较。在此还示出了由在三个测量点(底部光谱)与一个单一测量点(从底部光谱起的第二个光谱)下记录的数据生成的径谱之间的比较。使用多个测量点提供了具有较大准确度和较大分辨率的分辨谱。B:组分混合物在沿着该通道的和9mm处的三个不同测量点的分布以及对于通过最小平方算法生成的这些分布的拟合。
[0055]图3示出了在120分钟内由单体生长的的Αβ (1-42)聚集物的大小分布。A:随着时间的ThT荧光强度-在O分钟时(在任何聚集之前)、在30和50分钟时(在生长期之前和期间)、以及在单体已耗尽之后的120分钟内获取等份样品。B:大小分布发现使用以最大熵正规化拟合的最小平方。溶液最初是单体，在形成低聚物、原纤维以及最终的宏观原纤维“丛”之前。
[0056]图4示出了接头，该接头是其中一个组分流体流(白色)在三个不同的喷嘴或大横截面通道中遇到两个空白流体流(黑色)的点，这些喷嘴或通道从左开始具有300 μπκ1，000 ym和3，000 μ m的宽度，其中该宽度是指该喷嘴中的最大横截面，该宽度比在接头处的组流体流的宽度(即，具有30μπι、100μπι和300 μπι的宽度)宽十倍。大横截面通道允许建立一个清洁且限定的组分流，它在接头处具有一个减小的滞留时间(减小的停滞)。流速是4 μ LtT1并且组分是一种25nm胶质。
[0057]图5示出了微流体扩散光谱法的分辨率的数值评估，其中(A)是当用不同水平的随机噪声分辨的一种单一物质时在一个单峰的位置上的分数误差，并且(B)是在不同水平的随机噪声下分辨两种物质之前这两种物质之间的最小分数差分。
[0058]图6示出了在个别均质溶液中的A(胰高血糖素)、Β(β乳球蛋白)、以及C(BSA)和作为所有三种物质的1:1:1混合物的D的大小分布，表示为流体动力学半径。在365nm下使用一个倒置显微镜上的LED光源照射样品并且使用一个高量子产率CXD照相机检测这些样品。一个样品的稳态分布的测量的持续时间是10s。在出口处的总流速是40 μ Lh'
[0059]图7示出了 BSA在pH 7缓冲液的溶液和在80 % DMSO的溶液中的流体动力学半径，如通过本发明的一种方法测定的。
[0060]图8示出了(a)纯化的α B-晶状体蛋白的SDS-PAGE分析。与在变性条件下出现的大约20kDa相对应的条带与纯的单体α B-晶状体蛋白的预期分子质量20，159Da 一致；并且示出(b)未处理的和OPA-标记的α B-晶状体蛋白的MALD1-MS分析。在OPA-标记时出现的m/z-位移与大约2，200Da相对应。考虑到每个标签修饰增加176Da质量，这些结果表明完全标记每个α B-晶状体蛋白分子的11个胺(10个伯胺和N-末端胺)。
[0061]图9示出了(a) 30uMa B-晶状体蛋白在本发明的射流仪器中的扩散曲线。对于在
1、3和9cm处的三个测量点的扩散曲线描绘荧光强度对比通道位置的实验数据(实线)和相关拟合(虚线)，其中在90 μπι通道位置从顶部到底部的曲线与1、3和9cm曲线测量值相对应。并且示出了(b)30uMaB-晶状体蛋白的大小分布。两个群体代表单体和低聚体a B-晶状体蛋白。
[0062]图10示出了用DLS (暗线)和本发明的微流体装置(浅线)测量的30 μ M a B-晶状体蛋白的大小分布。扩散光谱法允许检测低大小的物质(约2nm)和低聚体物质(约6nm)。DLS专门揭示了反映a B-晶状体蛋白的低聚体形式的一个广泛大小分布峰(中心在约Snm处)。
[0063]图11示出了(a)使用α B-晶状体蛋白的一个蛋白质转位实验的电流跟踪。在一个负电压-500mV下使用50kHz贝塞尔滤波器进行这些实验；并且示出了(b)显示转位实验中的平均事件电流与事件持续时间之间的关系的一个二维散点图。事件的频率是通过侧面标度所示的阴影表示的。
[0064]图12 示出了在(a) 15 μΜ、(b)30yM、(c) 50 μ M、以及(d) 125 μ M 单体蛋白质浓度下的α B-晶状体蛋白的大小分布，如通过根据本发明的扩散光谱法测量的。
[0065]图13示出了脂质体的大小分布，如通过根据本发明的扩散光谱法测量的，其中这些脂质体具有(a)15nm和(c)50nm挤出半径和(e) 二者的一个1:1混合物。各个曲线表示在沿着扩散通道(在1、3和9cm处，其中在90 μπι通道位置上从顶部到底部的曲线与1、3和9cm曲线测量相对应)的不同测量点的扩散。对于所有三个测量点，穿过微型通道的荧光强度曲线(虚线)与对应最小平方拟合(实线)一起描绘。具有(b)15nm和(d)50nm挤出半径的脂质体和(f) 二者的一个1:1混合物的大小分布，如使用DLS (暗线)和微流体扩散(淡线)测量的。在大约4nm处的峰与游离的标记的脂质相对应。仅扩散光谱测量值确定此物质。
【具体实施方式】
[0066]本发明提供一种用于分析一种组分从一个流体流中扩散到另一个流体流中的方法。本发明人已发现对于一个标准T型接头流装置的改变允许以较大准确度测量该组分的扩散。具体地说，本发明人已发现当流体在接头处接触时使它们的停滞最小化或消除该停滞的一种方式。
[0067]如在此所述的，本发明人已发现在其中组分和空白流接触的接头处使用一个大横截面通道使流体停滞对扩散分析的有害影响最小化。如以下所述的，大横截面通道可以是在例如比下游通道宽度更宽十倍的区域中，其中进行扩散测量。本发明人已确定一个大横截面通道在接头处提供一个清洁且限定的组分流。因此，本发明人已将一个大横截面通道引入用于测量组分扩散的一个射流装置中。在大横截面通道下游是一个小横截面通道，该小横截面通道是检测通道。
[0068]使用一个大横截面通道被认为提高多种益处。首先，其中建立流的区域由于对于一个给定的流速(flow rate)相对更低的流动速度(flow velocity)而缩短。第二，由于接头到小流动通道的相对大小减小，较小比例的组分进入零级流动区域。第三，扩散相对于通道宽度w的净效应减小，因为速率尺度是I/ V w并且因此扩散距离是V Wo
[0069]这些效应的结果将在组分流和空白流进入小横截面通道时，提供用于组分流中的组分的良好限定的初始构型。因此，使用一个大流动通道是在例如小宽度通道下游的通道中建立一个恒定速率曲线之前使颗粒扩散最小化的一种有效方式，在该小宽度通道中进行扩散测量。
[0070]本发明的方法包括测量组分从一个组分流到一个相邻空白流中的径向扩散的步骤。从这些测量中，最终可以测量