检测EGFR耐药性突变的方法和组合物与流程

文档序号:11126256阅读:1648来源:国知局

本发明涉及基因靶向药物检测领域,具体涉及一种检测EGFR耐药性突变的方法和组合物。



背景技术:

表皮生长因子受体(EGFR)参与调节癌细胞中重要的增殖和生存相关的细胞功能,已被确定为治疗多种肿瘤的相关靶点。EGFR在多种肿瘤中常有体细胞单核苷酸变异或缺失或表达变化,这些变异位点常是第一代酪氨酸激酶抑制剂,如吉非替尼或厄洛替尼的靶向位点。

T790M突变是EGFR 20外显子中的一个点突变,就是EGFR蛋白的第790氨基酸由T(色氨酸)变成了M(甲硫氨酸),这个突变与第一代药物的失效密切相关。一项对出现耐药性的肺癌患者的研究表明约60%的耐药性来自于EGFR的T790M突变,4%同时有HER2扩增和T790M突变,3%同时有MET扩增和T790M突变,18%的患者耐药性产生的机理尚未明确。近30多年来,癌症已成为人类第一死因,目前,肺癌、肝癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌及鼻咽癌8个重点癌症占到了癌症死因的80%。若EGFR突变患者出现耐药性,其治疗效果则明显停滞并且药物的副作用还会加速患者的病情恶化,足见EGFR突变的检测对于预防和治疗癌症患者的重要性。

而现有技术中大多是对于T790M突变的检测和针对此突变位进行的药物治疗,而对于其它与EGFR突变引起的耐药性的研究还鲜见报道。



技术实现要素:

针对现有技术中的缺陷,本发明提供一种能快速准确测量M793K突变的检 测EGFR耐药性突变的方法和组合物。

M793K突变编码了EGFR蛋白中793位的变化,从野生型中的甲硫氨酸(M)变为突变体中的赖氨酸(K)。在用吉非替尼或厄洛替尼治疗前或早期,患者中很少出现这种突变,但是由于该突变消除了对这些药物敏感性,携带突变的癌细胞被阳性地选择,导致患者对进一步治疗产生顽固性。

第一方面,本发明提供的一种检测EGFR耐药性突变的组合物包括多个PCR引物;

所述PCR引物为:

(1)正向引物:5’-CGTTCGGCACGGTGTATAA-3’

反向引物:5’-GCCTCCTTCTGCATGGTATT-3’

或者

(2)正向引物:5’-GGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT-3’

反向引物:5’-ATAGTCCAGGAGGCAGCCGAA-3’。

也就是PCR引物为(1)和(2)中的任意一组。M793K是指EGFR 20外显子2378位核苷酸继发点突变,所述的两组包括EGFR cDNA序列核苷酸2378的引物对能够扩增片断,它可用于测序、限制长度多态性分析,或者用于确定是否存在2378T->A突变的任何其它技术,2378T->A突变即EGFR cDNA序列核苷酸2378位上T碱基突变为A碱基。

本发明提供的(1)或(2)组PCR引物在适宜的PCR条件下杂交至编码突变EGFR多肽的第一多核苷酸,或者它的多核苷酸片断,其中该引物杂交至在对应于EGFR cDNA碱基2378的位置上包括突变A的有义链序列或者反义链序列,而且该引物在所述PCR条件下很弱地或者根本不杂交至在2378位上含有野生型T的第二EGFR多核苷酸。

如序列表中第5项表皮生长因子受体DNA所示,(1)组中的正向引物为第104位至第122位DNA序列,(1)组中的反向引物为第542位至第561位的反向互补序列;(2)组中的正向引物为第130位至第143位DNA序列,(2)组中 的反向引物为第322位至第342位的反向互补序列。M793K突变点在各组中正反引物之间,突变点位于第317位,这样,通过PCR扩增即可检测出该突变。

优选地,上述检测EGFR耐药性突变的组合物还包括试剂盒;所述试剂盒包括Taq DNA Polymerase、dNTPs、反应缓冲液。Taq DNA Polymerase即TaqDNA聚合酶。

优选地,上述检测EGFR耐药性突变的组合物中所述试剂盒中Taq DNA Polymerase的浓度为2x。

优选地,上述检测EGFR耐药性突变的组合物中所述引物的终浓度为0.2uM,试剂盒中dNTPs终浓度为0.5uM,缓冲液10xTaq PCR Buffer的终浓度为1x。也就是说用于检测的引物的终浓度为0.2uM/L。

优选地,上述检测EGFR耐药性突变的组合物中所述用于配置引物的终浓度溶液的引物浓度为10uM。也就是说引物配置成最终浓度前是在10uM的浓度下进行储存,这样使得引物在配制成最终浓度能够更加准确。

第二方面,本发明提供了一种检测EGFR耐药性突变的方法,包括步骤:

A.模板制备:石蜡包埋组织切片中提取DNA,使用紫外分光光度计对其进行浓度调整,作为PCR检测的模板;

B.反应组分配制:分别配制检测混合物和阴性对照品混合物;其中,检测混合物按PCR混合液10.5uL、模板DNA溶液2uL,加ddH2O补至50ul配制一管;阴性对照品混合物按PCR混合液10.5uL,不加DNA模板,加ddH2O补至50ul配制一管;ddH2O即重蒸水;所述PCR混合液即如上所述的包含PCR引物及试剂盒的混合液;

C.扩增:分别将检测混合物、阴性对照品混合物放入PCR仪扩增,按以下程度进行扩增:

(1)94℃,2-5min,1cycle;即在94℃下反应2-5分钟使得DNA完全分开;

(2)循环重复如下步骤30-35次:

94℃ 30S

50-60℃ 30S

72℃ 1-2kb/min;

也就是先94℃下反应30秒,再在50-60℃退火30秒,然后在72℃在每分钟1-2kb的速度进行延伸,然后重复上述步骤,总共循环重复30-50次;

(3)72℃,5-10min;

D.结果判定:扩增产物直接点样电泳,如果检测物中扩增出片段和理论上设计引物时参照的目的片段大小一致,且阴性对照物无条带,说明样本DNA中含有该突变;如果检测物中没有扩增出片段,且阴性对照品无条带,说明检测物中不含该突变。

EGFR上新发现的点突变M793K,发明人通过分析得到出该突变和TKI抗药性相关。证据如下:该点突变的频率较高,真实存在;氨基酸改变由M变成K,由非极性氨基酸变成碱性氨基酸,变动大;位置重要,是TKI结合的关键氨基酸,M可和TKI形成氢键;临床实验中7例病人均表现出TKI治疗抗性,因为没有KRAS突变,因此抗性很可能是因为EGFR的突变引起的,6例病人未检测到已知的T790M和C797S抗性突变,1例病人检测到已知的C797S抗性突变,也推测M793K是一个抗性突变;TKI治疗后,M793K突变的丰度明显增加;发生突变后,EGFR与TKI的结合分值降低;细胞学证据表明,M793K突变后,对吉非替尼表现出抗性(以自身磷酸化程度作为鉴定指标)。而本发明则针对M793K突变进行了检测方法的研究,最终目的是早期鉴定顽固性病例以便于能够启动替代性治疗。

综上所述,利用本发明提供的组合物和检测方法检测EGFR耐药性突变,可以通过对癌症患者的EGFR上新发现的点突变M793K进行快速准确的检测,从而预测出TKI抗药性,本发明提供了一种新的检测方法或手段,进而能够实现分子分型精准医疗应用保护,针对本突变也能够更加准确有效地开发对应的靶向药物。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,因此只作为示例,而不能以此来限制本发明的保护范围。

本发明实施例共包含2个PCR反应,分别为检测混合物1管,阴性对照检测物1管。实施例具体检测操作步骤如下:

1.临床样本基因组提取:本实施例是从非小细胞肺癌患者肺部石蜡包埋组织切片中提取DNA,并对其进行定量,作为PCR检测的模板。采用Qiagen公司的QIAamp石蜡包埋组织提取试剂盒(Cat No.56404)。

(1)室温下平衡所有Buffers。

(2)水浴锅预热到70℃,buffer ATL、buffer AL 70℃溶解沉淀。

(3)用手术刀整齐地切除组织样品周边的多余石蜡。

(4)切下3-8片5-10um厚的组织切片,放入1.5ml的离心管中,加入1ml二甲苯(xylene),剧烈震荡10s。

(5)室温下,20000×g离心2min。

(6)用移液枪移除上清液,注意不要移除任何沉淀。

(7)添加1ml质量分数为95-100%的乙醇或乙醇水溶液至沉淀中,震荡仪震荡混匀。

(8)室温下,20000×g离心2min。

(9)用移液枪移除上清液,注意不要移除任何沉淀,用细小枪头尽量移除所有无水乙醇。

(10)打开管盖,37℃孵育10min,直到残余的无水乙醇全部蒸发掉。

(11)将沉淀重新悬浮在180ul的buffer ATL中。添加20ul的蛋白酶K,震荡仪震荡混匀。

(12)56℃孵育1h,直到样品被buffer ATL完全溶解。

(13)90℃孵育1h。

(14)瞬时离心,将盖子上的液滴离心下来;离心管中添加2ul RNase A(100mg/ml),室温孵育2min。

(15)添加200ul的buffer AL,震荡仪立即充分震荡混匀。

(16)添加200ul的无水乙醇,震荡仪立即充分震荡混匀。

(17)瞬时离心,将盖子上的液滴离心下来。

(18)将所有的溶解液转移到吸附柱中,6000×g离心1min,将吸附柱重新放置到新的收集管中。

(19)向吸附柱中添加500ul的buffer AW1,6000×g离心1min;将吸附柱重新放置到新的收集管中。

(20)向吸附柱中添加500ul的buffer AW2,6000×g离心1min,将吸附柱重新放置到新的收集管中;20000×g离心3min。

(21)将吸附柱移至新的1.5ml离心管中,添加50ul的buffer ATE到吸附柱膜的中央。

(22)室温孵育1min,20000×g离心1min。

2.紫外分光光度计测定DNA提取的质量及浓度并调整至50ng/ul。

3.配置PCR反应体系

全程4℃操作。各反应管组分含量及终浓度如下(每管总体系50ul):

4.扩增

将上述两管反应物放入PCR仪,设置反应程序如下:

(1)94℃ 2-5min

(2)循环重复如下步骤30-35次:

94℃ 30S

50-60℃ 30S

72℃ 1-2kb/min

(3)72℃ 5-10min。

5.电泳检测结果

检测物中检测出的条带和理论上设计引物时参照的目的片段大小一致,且阴性对照组未检测出条带,说明该样本中含有EGRF M793K突变。

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