本发明涉及动物分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种与香猪产仔数相关的大片段的获得与缺失(PAV)分子标记及其应用技术。
背景技术：
：长期以来，猪是我国农业生产中重要的畜种，猪品种基因组遗传水平的变异，导致猪种的生活习性、生长发育以及繁殖性能有着较大的差异。检测不同个体猪基因组的遗传变异是研究遗传变异与表型关系的基础。基因组的遗传变异可以分为序列变异和结构变异两种类型。基因组中结构变异的数量远远小于核苷酸序列变异数量，结构变异的数量在十万数量级，而SNP的数目一般在百万数量级以上，但结构变异影响到的基因组序列的总长度远远大于SNP。因此结构变异对基因组和动物性状影响的权重可能更大。基因组结构变异指基因组中获得与缺失变异和拷贝数变异，包括核苷酸序列的缺失、插入、复制、倒位和易位等。获得与缺失变异(PAV，presence/absencevariants)是一种重要的遗传变异形式，通过缺失或插入一个片段引起基因组结构上的变化，直接影响到基因组的大小和基因的数目，其突变频率与分布特征对于解释物种表型差异具有重要的意义。在人类的研究中已经发现许多与结构变异有关的疾病和生理特性，如自闭症、精神分裂症、母亲生殖能力等。发生结构变异有助于提高生物个体的适应性，促进物种的形成。我们前期运用二代测序技术，从香猪高产群和低产群中选取2头作为代表，进行全基因组结构变异检测，发现了一个长98675bp的结构变异PAV3在香猪群体中的分布频率有明显的不同，PAV3结构变异区内含有细胞周期末期促进复合物1(anaphasepromotingcomplexsubunit1,APC1)基因。APC1是细胞周期末期复合物(APC)最大的亚基，在整个细胞周期中持续表达，在细胞周期的调控过程中发挥着重要的作用。在拟南芥中APC1协同APC4在雌性配子的形成和胚胎发生中起重要的作用。因此建立本发明所描述的一种检测香猪产仔数相关的结构变异PAV3的方法，以期为实施香猪分子辅助育种提供技术支持。大于30kb的基因组片段通过常规的PCR方法常不能扩增出目的条带，因此，我们在缺失片段的外围设计了一对引物RP，当基因组中的这段区域缺失时，可以扩增出一个较小的目的条带。利用Pairwise-PCR的原理，在lsPAVs的边缘序列50～3000bp之间设计引物对RP，这对引物跨越整个lsPAVs区域，如果基因组中这段区域存在，将不能扩增出目的条带，若这段区域缺失，可能扩增出6000bp以内的片段。同时，在lsPAVs区域内部设计另一对特异引物RD，如果大片段缺失用这对引物对RD将不能扩增出目的条带，反之能扩增出目的条带。通过两对引物对RP和RD建立了本发明所描述的一种检测与香猪产仔数相关的结构变异PAV3的方法，以深入了解PAVs遗传变异对猪基因组的影响，为PAVs与经济性状和表型变化之间的关联研究奠定理论和技术基础。技术实现要素：本发明的目的是提供一种与香猪产仔数相关的PAV3标记及其应用。为实现本发明的目的，本发明的一种与香猪产仔数相关的PAV3标记，是指猪基因组中候选区域chr3：46248125-46346800的结构变异，该区域结构变异缺失98675bp，或不缺失。本发明提供用于检测与香猪产仔数相关的PAV3标记的引物对，所述RP引物对为正向引物RPF：CTGCACCTCACACAGCGACT，反向引物RPR：GCAGCACAGCCCTTGAACAG。RD引物对中的正向引物RDF：GTTCCCTGACCCCACTGACTG，反向引物RDR:CCTAGGCTGTCTGTGGTTGTTAG。本发明提供用于PCR检测前述与香猪产仔数相关的PAV3标记的试剂盒。所述试剂盒包含上述引物RPF、RPR和RDF、RDR。所述试剂盒还包括10×PCRMix、去离子水，阳性和阴性对照。本发明还提供所述PAV3标记在鉴定猪品种产仔数中的应用。所述检测方法包括以下步骤：(1)提取香猪的基因组DNA；(2)以上述香猪基因组DNA为模板，利用所述引物RPF、RPR和RDF、RDR，进行PCR扩增，检测猪基因组中PAV3的基因型；(3)根据上述检测结果，如果目的片断纯合缺失，则待测猪有产仔数较高的可能性；如果此片断不缺失，则待测个体有低产仔数倾向。步骤(2)中进行PCR所用的扩增体系以20μL为例：2×PCRMix10.00μLF-primer(0.10μg/μL)0.20μLR-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反应条件为：本发明进一步提供所述PAV3标记在香猪产仔数相关的分子标记辅助选择技术的应用。所述的应用包括以下步骤：(1)个体PAV3基因型检测以本发明所述的结构变异PAV3(chr3：46248125-46346800)为候选位点，采用PCR技术检测个体的PAV3基因型。(2)根据结构变异PAV3进行有高产仔数优势种猪的选育依据本发明所述的判断依据，当待测个体基因组中结构变异PAV3为缺失类型时，待测猪属于产仔数较高的优势个体。结构变异PAV3的检测，可为香猪产仔数的分子调控机理研究和标记辅助选择技术的实施提供技术基础。本发明的有益效果：(一)本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别、生活习性和环境等因素的限制，可用于个体的早期选择，从而提高香猪养殖业的经济效益。(二)本发明所述的检测大片段获得与缺失变异的方法准确可靠，操作简便，检测所需的条件普通实验室可以满足。(三)本发明可作为分子标记用于香猪产仔数性状的辅助选择。附图说明图1为本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测PAV3基因型的结果，M：DL2000DNAMarker；1-2：DD型；3-4：AA型；图2为本发明实施例1中Sanger测序的比对分析结果，细线代表缺失片段98675bp。具体实施方式以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。实施例1为本发明的检测方法，步骤如下：1.猪耳组织基因组DNA的提取本方法采用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(Cat.#DP304)，从猪耳组织中提取基因组DNA，具体方法如下：1)取小于50mg的耳组织置于2μL的离心管中，用手术剪充分剪碎；2)加入200μL缓冲液GA及20μL蛋白酶K，漩涡混匀，56℃消化2-4小时(每隔0.5小时混匀一次)至组织块消化完全；3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃消化10min；4)加入200μL无水乙醇，漩涡混匀；5)将消化液倒入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；8)重复操作步骤7)；9)将吸附柱CB3放回收集管中12000rpm空离心2min，弃废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；10)将吸附柱转移到干净的2mL离心管中，向吸附柱中间部悬空加入50-200μL洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min；基因组DNA转移到离心管中的TE溶液中，4℃保存备用或-20℃长期保存。11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液返回吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm离心2min；2.目标序列及参考序列的扩增根据NCBI数据库登录的该区域的序列设计引物，所述引物对为：正向引物RPF：CTGCACCTCACACAGCGACT，反向引物RPR：GCAGCACAGCCCTTGAACAG。RD引物为：正向引物RDF：GTTCCCTGACCCCACTGACTG，反向引物RDR:CCTAGGCTGTCTGTGGTTGTTAG。以20μL计PCR反应体系为：10×PCRMix10.00μLUp-primer(0.10μg/μL)0.20μLDown-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反应条件为：本试剂盒所包含的引物符合PCR扩增要求，扩增效果稳定、特异性强，PCR扩增结果可准确反应基因组中目标序列的结构变异类型。3.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物检测选用1％的琼脂糖凝胶。点样时，用微量加样器将PCR产物5μL，加入点样孔中，同时加入3μL的D2000DNAMarker(天根生化科技(北京)有限公司)对参照，设置电压为120V，时间为30min。电泳完成后，在凝胶成像系统中观察结果，并做好图像的保存。4.Sanger测序为了获得精确的PAV3的断点信息，我们通过Sanger测序技术对扩增片段进行了序列测定，将序列信息与猪参考基因组序列(ref.Sscrofa10.2)进行比对分析，确定基因组中PAV3区域的精确断点位置实施例2香猪群体结构变异PAV3的检测及应用按照实施例1所述的方法，以猪基因组区域结构变异位点(chr3：46248125-46346800)为候选位点，通过PCR技术检测PAV3在香猪群体(香猪470头，其中产仔数高的个体230头，产仔数低的个体240头)中的结构变异情况。480头香猪的血样采自从江县。应用本发明所述的检测技术分析群体中的结构变异PAV3的分布频率，结果显示香猪高低产群体中存在PAV3变异(表1)。香猪基因组结构变异中，基因型DD型的香猪的产仔数高于基因型AA型的香猪的产仔数(P<0.05)(表2)。表1香猪群体中候选PAV3位点的基因型频率和等位基因频率检测结果表2候选PAV3基因型对应的产仔数比较应用本发明建立的检测技术可检测待测个体基因组中结构变异PAV3的基因型，不受香猪的年龄、性别、地理位置和环境等因素的限制，且操作简便，结果准确。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做部分修改或改进，这对本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求的保护范围。当前第1页1 2 3