弓形虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及弓形虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒。

背景技术：

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，可以感染所有的温血动物，猫科动物是弓形虫的终末宿主。据报道全球三分之一的人感染弓形虫，对人类健康、伴侣动物健康、养殖业等造成巨大威胁。弓形虫的传播主要通过三种途径：一种是土壤、水等环境中的弓形虫卵囊被摄入体内；一种是通过食入未煮熟的感染有弓形虫的肉类；一种是母婴传播。目前没有有效的驱除方法，一旦感染将寄生体内终身，当免疫力低下或免疫力缺陷时，如患艾滋病，就可发病。综上，建立一种快速简便的弓形虫检测方法显得尤为重要，用于环境评估，食品安全检测，养殖场现场诊断等，进而采取措施遏制传播。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了弓形虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：弓形虫核酸的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：

RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；

所述RPA引物探针混合液中的引物序列为：

上游引物：5'-CTTCTGCCTTTGTTCTTTTAGCCTCAATAG-3'；

下游引物：5'-biotin-ATTAAGCGACCAACCTTGTCCTGATGACAC-3'；

探针序列为：

5'-FAM-CTCCCTCCTATCTTTCAGCCAACCCAGCAA-THF-CACCGACGAACTCTC-Spacer C3-3'；

所述PBST溶液的制备方法为：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液中，混匀即可。

进一步的，上述的弓形虫核酸的快速检测试剂盒，每16μl所述RPA引物探针混合液的制备方法为：将上游引物21pmol，下游引物21pmol，探针6pmol混合于16μl纯水中。

本发明的第二个目的是提供了上述弓形虫核酸的快速检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，所述检测方法使用上述的弓形虫核酸的快速检测试剂盒，检测方法包括以下步骤：

1）对弓形虫核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；

扩增时所使用的引物和探针为：

上游引物：5'-CTTCTGCCTTTGTTCTTTTAGCCTCAATAG-3'；

下游引物：5'-biotin-ATTAAGCGACCAACCTTGTCCTGATGACAC-3'；

探针：5'-FAM-CTCCCTCCTATCTTTCAGCCAACCCAGCAA-THF-CACCGACGAACTCTC-Spacer C3-3'；

2）将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验，判定弓形虫阳性或阴性。

进一步的，上述的弓形虫核酸的快速检测方法，所述步骤1）中重组酶聚合酶扩增的反应体系为：弓形虫核酸样品2μl，RPA引物探针混合液16μl，RPA反应预混液32μl，RPA反应冻干酶5 mg；反应条件为：在30℃-45℃条件下反应15-20分钟。

进一步的，上述的弓形虫核酸的快速检测方法，所述步骤2）中将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验的具体方法为：取2μl扩增产物与200μl PBST溶液混匀，然后吸取10μl混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μl PBST溶液的离心管中，5分钟后观察结果；

所述PBST溶液的制备方法为：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液中，混匀即可。

本发明的第三个目的是提供了上述弓形虫核酸的快速检测方法在检测弓形虫核酸中的应用，其特征在于，所述检测不以疾病的诊断和治疗为目的。

进一步的，上述的应用，所述弓形虫核酸来源于弓形虫所有基因型和所有发育阶段。

本发明的有益效果为：本发明提供的弓形虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒，是建立在分子生物学基础上的，先基于弓形虫B1基因设计了特定引物和探针，该基因对所有的弓形虫基因型高度保守，而又对其他病原高度特异，再应用重组酶聚合酶扩增（RPA）-测流层析的方法制备了快速检测弓形虫核酸的试剂盒，敏感性高于巢式PCR，特异性强，整个过程只需30分钟，结果的判定只需观察测流层析试纸条是否是两条杠，操作极其简便；得到核酸样品后整个反应过程可以在非实验室环境下进行，不仅适用于临床诊断而且可以应用于食品安全检测、养殖场现场检测、环境评估等多种领域。

附图说明

图1显示为本发明的试剂盒的敏感性实验结果。

图2显示为本发明的试剂盒的特异性实验结果。

具体实施方式

实施例1：

本发明的弓形虫核酸快速检测试剂盒包括：

RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条（Milenia Hybridtech 1 strips, Milenia Biotec），RPA试剂盒（TwistAmp nfo kit，TwistDx）提供的冻干酶和RPA反应预混液（29.5μl Rehydration Buffer和2.5μl 280mM Magnesium Acetate混合液）。

具体制备方法为：

（1）引物探针混合液：本申请针对弓形虫的B1基因引物和探针，具体核苷酸序列如下：

上游引物：5'-CTTCTGCCTTTGTTCTTTTAGCCTCAATAG-3'；

下游引物：5'-biotin-ATTAAGCGACCAACCTTGTCCTGATGACAC-3'；

探针：5'-FAM-CTCCCTCCTATCTTTCAGCCAACCCAGCAA-THF-CACCGACGAACTCTC-Spacer C3-3'。

将上游引物21 poml、下游引物21 pmol、探针6 pmol混合于16μl纯水中，得到引物探针混合液。

（2）PBST 溶液：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液当中，备用。

本发明的试剂盒的使用方法为：

RPA反应体系为：2μl的核酸样品，16μl的引物探针混合液，RPA反应预混液32μl，RPA反应冻干酶5 mg；反应条件为：反应温度为30℃-45℃之间，反应时间为15到20分钟。

反应后吸取2μl RPA扩增产物与200μl PBST溶液混匀，接着吸取10μl混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，最后将试纸条竖着插入的装有200μl PBST溶液的离心管中，5分钟后观察结果，如果试纸条为两条杠，则为弓形虫阳性，如果为一条杠则为阴性。

实施例2：

具体应用实施例：

应用本发明的试剂盒快速检测弓形虫的方法如下：

（1）RPA扩增反应：

吸取2μl核酸样品，与准备好的16μl的引物探针混合液、32μl的RPA反应预混液一同加入到装有RPA反应冻干酶的离心管中，混匀。在30℃-45℃条件下（可以捂在手中或腋窝下）反应15-20分钟。

（3）反应产物的检测：

反应后吸取2μl RPA扩增产物与200μl PBST溶液混匀，接着吸取10μl混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，最后将试纸条竖着插入的装有200μl PBST溶液的离心管中，5分钟后观察结果，如果试纸条为两条杠，则为弓形虫阳性，如果为一条杠则为阴性。

实施例3：

本发明的试剂盒的敏感性实验：

实验过程为：将纯化的弓形虫卵囊提取DNA，并进行RPA扩增反应，每个扩增反应中加入的弓形虫卵囊DNA的量分别为10³，10²，10，1， 0.1，0.01个。反应后按照前面提到的方法进行测流层析试纸条检测，结果显示，该方法可以检测到反应体系中加入0.1个弓形虫卵囊的DNA。

实验结果参见图1（注：对照条带的显现是为了显示试纸条功能正常，检测条带的显现表示阳性；NC为空白对照）。

实施例4：

本发明的试剂盒的特异性实验：

实验过程为：用微小隐孢子虫，蓝氏贾第虫，微孢子虫，艾美尔球虫，新孢子虫和哈蒙球虫的DNA与弓形虫DNA进行特异性分析，结果发现该试剂盒只能检测到弓形虫DNA。

实验结果参见图2（注：对照条带的显现是为了显示试纸条功能正常，检测条带的显现表示阳性）。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 弓形虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

cttctgcctt tgttctttta gcctcaatag 30

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

attaagcgac caaccttgtc ctgatgacac 30

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 探针

<400> 1

ctccctccta tctttcagcc aacccagcaa caccgacgaa ctctc 45

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 弓形虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

cttctgcctt tgttctttta gcctcaatag 30

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

attaagcgac caaccttgtc ctgatgacac 30

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 探针

<400> 1

ctccctccta tctttcagcc aacccagcaa caccgacgaa ctctc 45