小麦基因TaSPL20‑7D分子标记及其在鉴定小麦产量相关性状中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
中，小麦基因TaSPL20-7D分子标记及其在鉴定小麦产量相关性状中的应用。
背景技术：
：小麦是世界性的粮食作物，利用各种途径来提高小麦产量成为包括育种家在内的许多科学家的主要目的之一。传统的通过表型筛选的育种模式耗时和费力，而功能标记的开发为小麦育种过程中选育优异株系提供了更为方便快捷的方法。随着分子生物技术的发展，重要基因的功能不断被揭示，在作物遗传改良中高效利用这些基因已成为基因发掘的重要目标。分子标记辅助选择技术为提高目标性状选择效率，改良作物提供了一条新的有效途径。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何鉴定小麦产量相关性状，如千粒重和/或株高。为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述A1)或A2)的应用：A1)小麦分子标记dCAPS-7D-SNP1在鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状中的应用；所述小麦分子标记dCAPS-7D-SNP1为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第646位的核苷酸，所述dCAPS-7D-SNP1为A或C；A2)小麦成套分子标记在鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状中的应用；所述成套小麦分子标记，由所述小麦分子标记dCAPS-7D-SNP1和小麦分子标记CAPS-7D-SNP2组成，所述CAPS-7D-SNP2为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第765位的核苷酸，所述CAPS-7D-SNP2为C或T。上述应用中，所述dCAPS-7D-SNP1和所述CAPS-7D-SNP2在小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1均可为序列1、序列2或序列3。序列1与序列2的序列仅在第646位与第765位不同，序列1的第646位为A、第765位为C，序列2的第646位为C、第765位为T；序列3与序列1的序列仅在第646位不同，序列1的第646位为A，序列3的第646位为C。上述应用中，所述小麦产量相关性状可为小麦千粒重和/或株高。为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的引物。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的引物，为引物对P或成套引物；所述引物对P为能与小麦基因组DNA中所述小麦分子标记CAPS-7D-SNP2上下游特异结合的两条单链DNA；所述成套引物由所述引物对P与引物对Q组成；所述引物对Q为能与小麦基因组DNA中所述小麦分子标记dCAPS-7D-SNP1上下游特异结合的两条单链DNA。上述引物中，所述引物对P可由p1和p2组成，所述p1为如下a1)至a4)中的任一种：a1)序列表中序列4所示的单链DNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述p2为如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：b1)序列表中序列5所示的单链DNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述引物对Q可由q1和q2组成，所述q1为如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：c1)序列表中序列6所示的单链DNA；c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述q2为如下d1)至d4)中的任一种单链DNA：d1)序列表中序列7所示的单链DNA；d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；d3)与d1)或d2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。上述引物中，a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在序列4所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在序列5所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在序列6所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。d2)所述在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在序列7所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列4、序列5、序列6或序列7所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述引物中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。所述引物对P的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。所述引物对P的两条单链DNA可独立包装。所述引物对Q的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。所述引物对Q的两条单链DNA可独立包装。所述成套引物中，所述引物对P与所述引物对Q可单独使用也可在一起使用，在一起使用时，所述引物对P与所述引物对Q的摩尔比没有要求，可根据具体需要确定。上述引物中，所述小麦产量相关性状可为小麦千粒重和/或株高。为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的成套试剂。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的成套试剂，由所述引物与M组成，所述M为限制性内切酶AvaⅡ和/或BamHⅠ。其中，所述引物的各单链DNA与限制性内切酶AvaⅡ和/或BamHⅠ可独立包装。上述成套试剂中，所述小麦产量相关性状可为小麦千粒重和/或株高。为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法，所述方法为下述X1)或X2)：X1)所述基因型为CC基因型、CA基因型和AA基因型，所述方法包括：检测待测小麦基因组中对应于序列1的第646位的核苷酸，如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述f1)的染色体，所述待测小麦为CC基因型；如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述f2)的染色体，所述待测小麦为AA基因型；如所述待测小麦基因组中两条染色体中一条为下述f1)的染色体，另一条为下述f2)的染色体，所述待测小麦为CA基因型；f1)对应于序列1的第646位为C；f2)对应于序列1的第646位为A；X2)所述基因型为A1A1基因型、A2A2基因型、A3A3基因型、A1A2基因型、A1A3基因型和A2A3基因型，所述方法包括：检测待测小麦基因组中对应于序列1的第646位和第765位的核苷酸，如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测小麦为A1A1基因型；如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测小麦为A2A2基因型；如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述g3)的染色体，所述待测小麦为A3A3基因型；如所述待测小麦基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测小麦为A1A2基因型；如所述待测小麦基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g3)的染色体，所述待测小麦为A1A3基因型；如所述待测小麦基因组中两条染色体中一条为下述g2)的染色体，另一条为下述g3)的染色体，所述待测小麦为A2A3基因型；g1)对应于序列1的第646位为A且对应于序列1第765位为C；g2)对应于序列1的第646位为C且对应于序列1第765位为T；g3)对应于序列1的第646位为C且对应于序列1第765位为C。其中，AA基因型小麦的千粒重高于CC基因型小麦的千粒重；CC基因型小麦的株高高于AA基因型小麦的株高。A1A1基因型小麦的千粒重高于A2A2基因型和A3A3基因型小麦；A2A2基因型小麦的株高高于A1A1基因型小麦。由于DNA分子由两条互补的单链DNA组成，在检测小麦基因组中对应于序列1的第646位核苷酸时，需考虑到该位点的侧翼序列，如果该位点的侧翼序列与序列1的第646位核苷酸的侧翼序列在相同的位置是相同而不是互补关系时(序列1的第765位除外)，检测得到的该位点的核苷酸即为待测小麦基因组中对应于序列1的第646位的核苷酸；如果该位点的侧翼序列与序列1的第646位核苷酸的侧翼序列在相同的位置存在互补关系而不相同时(序列1的第765位除外)，与检测得到的该位点的核苷酸存在配对关系的脱氧核苷酸即为待测小麦基因组中对应于序列1的第646位的核苷酸。所述相同位置是指小麦基因组中距离对应于序列1的第646位核苷酸的长度与序列1中距离第646位核苷酸的长度相同的位置，当然，由于序列1长度有限，序列1中距离第646位核苷酸的长度可延伸至序列1未显示而小麦基因组中实际是序列1第646位核苷酸两侧的序列中。在检测小麦基因组中对应于序列1的第765位核苷酸时，需考虑到该位点的侧翼序列，如果该位点的侧翼序列与序列1的第765位核苷酸的侧翼序列在相同的位置是相同而不是互补关系时(序列1的第646位除外)，检测得到的该位点的核苷酸即为待测小麦基因组中对应于序列1的第765位的核苷酸；如果该位点的侧翼序列与序列1的第765位核苷酸的侧翼序列在相同的位置存在互补关系而不相同时(序列1的第646位除外)，与检测得到的该位点的核苷酸存在配对关系的脱氧核苷酸即为待测小麦基因组中对应于序列1的第765位的核苷酸。所述相同位置是指小麦基因组中距离对应于序列1的第765位核苷酸的长度与序列1中距离第765位核苷酸的长度相同的位置，当然，由于序列1长度有限，序列1中距离第765位核苷酸的长度可延伸至序列1未显示而小麦基因组中实际是序列1第765位核苷酸两侧的序列中。上述鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法中，X1)所述方法中，所述检测待测小麦基因组中对应于序列1的第646位的核苷酸，X1)所述方法包括：以待测小麦基因组DNA为模板，利用权利要求2或3中所述引物对P进行PCR扩增得到PCR产物；检测所述PCR产物的序列，确定所述待测小麦基因组中对应于序列1的第646位的核苷酸；X2)所述方法中，所述检测待测小麦基因组中对应于序列1的第646位和第765位的核苷酸，X2)所述方法包括下述L或M：L、以待测小麦基因组DNA为模板，利用所述引物对P进行PCR扩增得到PCR产物；检测所述PCR产物的序列，确定所述待测小麦基因组中对应于序列1的第646位和第765位的核苷酸；M、下述M1和M2：M1、以待测小麦基因组DNA为模板，利用所述引物对P进行PCR扩增得到PCR产物A，利用权利要求2或3中所述引物对Q进行PCR扩增得到PCR产物B；M2、采用限制性内切酶BamHⅠ处理所述PCR产物A，得到酶切产物A，采用限制性内切酶AvaⅡ处理所述PCR产物B，得到酶切产物B，检测所述酶切产物A和所述酶切产物B的序列和/或大小，根据所述酶切产物A和所述酶切产物B中的DNA片段数确定所述待测小麦基因组中对应于序列1的第765位和第646位的核苷酸：如所述酶切产物A为两条DNA片段，且所述酶切产物B为一条DNA片段，所述待测小麦基因组中两条染色体均为所述g1)的染色体；如所述酶切产物A为一条DNA片段，且所述酶切产物B为两条DNA片段，所述待测小麦基因组中两条染色体均为所述g2)的染色体；如所述酶切产物A为两条DNA片段，且所述酶切产物B为两条DNA片段，所述待测小麦基因组中两条染色体均为所述g3)的染色体；如所述酶切产物A为两条DNA片段，且所述酶切产物B为三条DNA片段，所述待测小麦基因组中两条染色体一条为所述g1)的染色体，另一条为所述g3)的染色体；如所述酶切产物A为三条DNA片段，且所述酶切产物B为两条DNA片段，所述待测小麦基因组中两条染色体一条为所述g2)的染色体，另一条为所述g3)的染色体；如所述酶切产物A和所述酶切产物B均为三条DNA片段，检测所述PCR产物A的序列确定所述待测小麦基因组中两条染色体对应于序列1的第646位和第765位的核苷酸。其中，所述酶切产物A为一条DNA片段时，这条DNA片段的大小为1791bp；所述酶切产物A为两条DNA片段时，这两条DNA片段的大小分别为762bp左右和1029bp左右；所述酶切产物A为三条DNA片段时，这三条DNA片段的大小分别为762bp左右、1029bp左右和1791bp。在电泳检测时，1791bp的DNA片段具体可体现为在DNA分子量标准中距1791bp最近的两条带间有一条带，762bp左右的DNA片段具体可体现为在DNA分子量标准中距762bp左右最近的两条带间有一条带，1029bp左右的DNA片段具体可体现为在DNA分子量标准中距1029bp左右最近的两条带间有一条带。所述酶切产物B为一条DNA片段时，这条DNA片段的大小为178bp；所述酶切产物A为两条DNA片段时，这两条DNA片段的大小分别为28bp左右和150bp左右；所述酶切产物A为三条DNA片段时，这三条DNA片段的大小分别为28bp左右、150bp左右和178bp。在电泳检测时，178bp的DNA片段具体可体现为在DNA分子量标准中距178bp最近的两条带间有一条带，28bp左右的DNA片段具体可体现为在DNA分子量标准中距28bp左右最近的两条带间有一条带，150bp左右的DNA片段具体可体现为在DNA分子量标准中距150bp左右最近的两条带间有一条带。上述鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法中，利用所述引物对P进行PCR扩增的反应体系(反应体系P)可含有：PCRbuffer、所述p1和所述p2、dNTPs、DNA聚合酶、基因组DNA和水。所述反应体系P中所述p1和所述p2的浓度均可为0.2μmol/L。所述反应体系P中所述DNA聚合酶具体可为transfastpfu酶。所述反应体系P具体可为：ddH2O8.0μL、5×PCRbuffer3.0μL、引物p1(5μmol/L)和p2(5μmol/L)各0.6μL、dNTPs(2.5μmol/L)0.4μL、transfastpfu酶(5U)0.3μL、基因组DNA(20ng/μL)2.1μL。其中，5×PCRbuffer和transfastpfu(5U)均可为北京全式金生物技术有限公司产品,dNTPs可为Roche公司产品。利用所述引物对P进行PCR扩增的退火温度可为59℃。利用所述引物对P进行PCR扩增的退火条件可为59℃30s。利用所述引物对P进行PCR扩增的条件具体可为:95℃5min；95℃30s,59℃30s,72℃30s,35次循环；72℃10min。上述鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法中，利用所述引物对Q进行PCR扩增的反应体系(反应体系Q)可含有：PCRbuffer、所述q1和所述q2、dNTPs、DNA聚合酶、基因组DNA和水。所述反应体系Q中所述q1和所述q2的浓度均可为0.2μmol/L。所述反应体系Q具体可为：ddH2O2.8μL、2×TaqPCRMasterMix5.0μL、引物q1(5μmol/L)和q2(5μmol/L)各0.6μL、基因组DNA或所述PCR产物A。其中，2×TaqPCRMasterMix可为天根生化科技有限公司产品。利用所述引物对Q进行PCR扩增的退火温度可为60℃。利用所述引物对Q进行PCR扩增的退火条件可为60℃30s。利用所述引物对Q进行PCR扩增的条件具体可为:95℃5min；95℃30s,60℃30s,72℃30s,33次循环；72℃10min。上述鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法中，所述采用限制性内切酶BamHⅠ处理所述PCR产物A的体系可为：10×digestbuffer1.0μL、BamHⅠ0.3μL、所述PCR产物A4.0μL、ddH2O4.7μL。所述采用限制性内切酶AvaⅡ处理所述PCR产物B的体系可为：10×digestbuffer1.0μL、AvaⅡ0.3μL、所述PCR产物B4.0μL、ddH2O4.7μL。上述鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法中，检测待测小麦基因组DNA中对应于序列1的第646位和第765位的核苷酸时，只要可以检测出这两个位点的核苷酸即可，如通过DNA杂交的方法进行检测，具体可如Southern印记杂交。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Y1)或Y2)或Y3)：Y1)鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的方法，为下述Y11)或Y12)：Y11)鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的方法，包括按照X1)所述方法鉴定待测小麦的基因型，根据待测小麦的基因型确定所述待测小麦的千粒重性状：AA基因型待测小麦的千粒重高于或候选高于CC基因型待测小麦的千粒重；Y12)鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法，包括按照X1)所述方法鉴定待测小麦的基因型，根据待测小麦的基因型确定所述待测小麦的株高性状：AA基因型待测小麦的株高小于或候选小于CC基因型待测小麦的株高；Y2)鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的方法，为下述Y21)或Y22)：Y21)鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的方法，包括按照中X2)所述方法鉴定待测小麦的基因型，根据待测小麦的基因型确定所述待测小麦的千粒重性状：A1A1基因型待测小麦的千粒重高于或候选高于A2A2基因型和A3A3基因型待测小麦的千粒重；Y22)鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法，包括按照X2)所述方法鉴定待测小麦的基因型，根据待测小麦的基因型确定所述待测小麦的株高性状：A2A2基因型待测小麦的株高高于或候选高于A1A1基因型待测小麦的株高；Y3)小麦育种方法，按照所述鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法鉴定小麦的基因型，选择AA基因型或A1A1基因型的小麦作为亲本进行育种。为解决上述技术问题，本发明还提供了所述小麦成套分子标记、所述dCAPS-7D-SNP1或所述CAPS-7D-SNP2。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Ⅰ-Ⅵ中的任一种：Ⅰ、所述引物在下述Z1-Z5任一种中的应用：Z1、鉴定或辅助鉴定小麦基因型；Z2、制备鉴定或辅助鉴定小麦基因型产品；Z3、鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状；所述小麦产量相关性状为小麦千粒重和/或株高；Z4、制备鉴定或辅助鉴定所述小麦产量相关性状产品；Z5、小麦育种；Ⅱ、所述成套试剂在上述Z1-Z5任一种中的应用；Ⅲ、所述鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法在上述Z3或Z5中的应用；Ⅳ、所述鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的方法在上述Z5中的应用；Ⅴ、所述小麦成套分子标记、所述dCAPS-7D-SNP1或所述CAPS-7D-SNP2在上述Z5中的应用；Ⅵ、检测所述小麦成套分子标记、所述dCAPS-7D-SNP1或所述CAPS-7D-SNP2的物质在上述Z1-Z5任一种中的应用。所述检测所述小麦成套分子标记、所述dCAPS-7D-SNP1或所述CAPS-7D-SNP2的物质可由所述引物或所述成套试剂与进行PCR扩增所需的其他试剂和/或仪器组成。所述进行PCR扩增所需的其他试剂可为含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。本发明中，所述小麦产量相关性状可为小麦千粒重和/或株高。本发明中，在检测PCR产物的大小时，可通过电泳检测，也可通过测序检测。实验证明，本发明的发明人发现了与小麦产量和株型相关的小麦分子标记dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2，根据dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2对小麦进行基因型分型，共可以得到三种均为纯合型的基因型，即A1A1基因型、A2A2基因型和A3A3基因型；根据dCAPS-7D-SNP1对小麦进行基因型分型，共可以得到两种均为纯合型的基因型，即AA基因型和CC基因型。A1A1基因型小麦的千粒重极显著地(P<0.01)分别高于A2A2基因型和A3A3基因型小麦的千粒重，A2A2基因型小麦的千粒重与A3A3基因型小麦的千粒重没有显著差异；A2A2基因型小麦的株高极显著地(P<0.01)高于A1A1基因型小麦的株高，A1A1基因型与A3A3基因型小麦、A2A2基因型与A3A3基因型小麦的株高差异均未达到极显著水平；CC基因型的小麦的千粒重显著小于AA基因型的小麦的千粒重，CC基因型的小麦的株高显著大于AA基因型的小麦的株高。说明本发明中的dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2与小麦的株高和千粒重相关，dCAPS-7D-SNP1也单独与小麦的株高和千粒重相关，能够在选育小麦具有优异产量性状中起作用。本发明为小麦分子标记辅助选择育种提供了一个新的方法，在培养高产量小麦品种或研究中具有重要意义。附图说明图1为三种基因型的dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2的核苷酸与检测。其中，图1中a为dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2的核苷酸；图1中b为三种基因型的dCAPS-7D-SNP1位点的检测结果，C表示A2A2和A3A3基因型的检测结果，A表示A1A1基因型的检测结果；图1中c为三种基因型的CAPS-7D-SNP2位点的检测结果，C表示A1A1和A3A3基因型的检测结果，T表示A2A2基因型的检测结果。SNP1表示dCAPS-7D-SNP1，SNP2表示CAPS-7D-SNP2。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的5×PCRbuffer和transfastpfu(5U)均为北京全式金生物技术有限公司产品,产品目录号分别为AP221-02；dNTPs为Roche公司产品，产品货号为#316K5S；2×TaqPCRMastermix为天根生化科技有限公司产品,产品货号为KT201-01。下述实施例中的BamHⅠ和AvaⅡ为Fermentas公司产品，产品目录号分别为ER0051和ER0311，10×digestbuffer为Fermentas公司产品。下述实施例中小麦均为国家种质资源库的小麦。实施例1、小麦成套分子标记与小麦产量相关性状相关一、dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2的发现本发明的发明人根据表1中32份普通六倍体小麦品种(来自于国家种质资源库，公众可从国家种质资源库获得)发现了两个与小麦千粒重和株高相关的小麦分子标记，将这两个小麦分子标记分别命名为dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2，dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2组成得到小麦成套分子标记，dCAPS-7D-SNP1为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第646位的核苷酸，dCAPS-7D-SNP1为A或C，CAPS-7D-SNP2为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第765位的核苷酸，CAPS-7D-SNP2为C或T。表1、32份普通六倍体小麦品种以小麦基因组DNA为模板、利用两条引物分别与小麦基因组中对应于序列1的第646位上游和第765位下游特异结合的引物对P进行PCR扩增得到的PCR产物，将该PCR产物命名为PCR产物A，在不同的小麦品种PCR产物A中共有三种序列，序列1、序列2和序列3。引物对P由名称为p1和p2的单链DNA组成，p1为序列4所示的单链DNA，p2为序列5所示的单链DNA。序列1与序列2的序列仅在第646位与第765位不同，序列1的第646位为A、第765位为C，序列2的第646位为C、第765位为T；序列3与序列1的序列仅在第646位不同，序列1的第646位为A，序列3的第646位为C。按照如下两种方式对小麦基因分型：针对dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2，将PCR产物A的序列仅为序列1的小麦命名为A1A1基因型小麦；将PCR产物A的序列仅为序列2的小麦命名为A2A2基因型小麦；将PCR产物A的序列仅为序列3的小麦命名为A3A3基因型小麦；将PCR产物A的序列仅为序列1和序列2的小麦命名为A1A2基因型小麦；将PCR产物A的序列仅为序列1和序列3的小麦命名为A1A3基因型小麦；将PCR产物A的序列仅为序列2和序列3的小麦命名为A2A3基因型小麦(图1中a)；针对dCAPS-7D-SNP1，将PCR产物A的第646位为A的小麦命名为AA基因型小麦；将PCR产物A的第646位为C的小麦命名为CC基因型小麦；将PCR产物A的第646位为A和C的小麦命名为CA基因型小麦。序列1和序列3的第760-765位为限制性内切酶BamHⅠ的识别序列，而序列2不含BamHⅠ的识别序列。利用BamHⅠ对PCR产物A进行酶切，将得到的酶切产物命名为酶切产物A，酶切产物A共有三种类型：A1A1基因型、A3A3基因型和A1A3基因型小麦的酶切产物A均为两条DNA片段，一条大小为762bp左右，另一条为1029bp左右；A2A2基因型小麦的目标序列无BamHⅠ的酶切位点,其产物为一条1791bp的DNA片段；A1A2基因型和A2A3基因型小麦的酶切产物A均为三条DNA片段，一条大小为762bp左右，另一条大小为1029bp左右，第三条大小为1791bp。在以PCR产物A或小麦基因组DNA为模板，利用引物对Q进行PCR扩增时得到的PCR产物(将其命名为PCR产物B)的序列共有两种：①将序列1的第616-793位中的第642-643位突变为CC得到的序列，该序列未引入限制性内切酶AvaⅡ的识别序列；②将序列2或序列3的第616-793位中的第642-643位突变为CC得到的序列，该序列引入了AvaⅡ的识别序列。利用AvaⅡ对PCR产物B进行酶切，将得到的酶切产物命名为酶切产物B，酶切产物B共有三种类型：A1A1基因型小麦的目标序列无AvaⅡ的酶切位点,其酶切产物B为一条178bp的DNA片段；A2A2基因型、A3A3基因型和A2A3基因型小麦的酶切产物B均为两条DNA片段，一条大小为28bp左右，另一条为150bp左右；A1A2基因型和A1A3基因型小麦的酶切产物B均为三条DNA片段，一条大小为28bp左右，另一条大小为150bp左右，第三条大小为178bp。在鉴定针对dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2进行分型的小麦的基因型(A1A1基因型、A2A2基因型、A3A3基因型、A1A2基因型、A1A3基因型或A2A3基因型)时，按照如下L或M的方法进行鉴定：L、以待测小麦基因组DNA为模板，利用引物对P进行PCR扩增得到PCR产物A；检测PCR产物A的序列，确定待测小麦基因组中对应于序列1的第646位和第765位的核苷酸，进一步确定待测小麦的基因型；M、下述M1和M2：M1、以待测小麦基因组DNA为模板，利用引物对P进行PCR扩增得到PCR产物A，利用引物对Q进行PCR扩增得到PCR产物B；M2、采用限制性内切酶BamHⅠ酶切PCR产物A，得到酶切产物A，采用限制性内切酶AvaⅡ酶切PCR产物B，得到酶切产物B，检测酶切产物A和酶切产物B的序列或大小，根据酶切产物A和酶切产物B中的DNA片段数确定待测小麦基因组中对应于序列1的第646位和第765位的核苷酸，进一步确定待测小麦的基因型：如酶切产物A为两条DNA片段，且酶切产物B为一条DNA片段，待测小麦基因组中两条染色体均为下述g1)，即待测小麦为A1A1基因型小麦；如酶切产物A为一条DNA片段，且酶切产物B为两条DNA片段，待测小麦基因组中两条染色体均为下述g2)，即待测小麦为A2A2基因型小麦；如酶切产物A为两条DNA片段，且酶切产物B为两条DNA片段，待测小麦基因组中两条染色体均为下述g3)，即待测小麦为A3A3基因型小麦；如酶切产物A为两条DNA片段，且酶切产物B为三条DNA片段，待测小麦基因组中两条染色体一条为下述g1)，另一条为下述g3)，即待测小麦为A1A3基因型小麦；如酶切产物A为三条DNA片段，且酶切产物B为两条DNA片段，待测小麦基因组中两条染色体一条为下述g2)，另一条为下述g3)，即待测小麦为A2A3基因型小麦；如酶切产物A为三条DNA片段，且酶切产物B为三条DNA片段，需要通过对PCR产物A进行测序确定待测小麦是否为A1A2基因型小麦；g1)对应于序列1的第646位为A且对应于序列1第765位为C；g2)对应于序列1的第646位为C且对应于序列1第765位为T；g3)对应于序列1的第646位为C且对应于序列1第765位为C。在鉴定针对dCAPS-7D-SNP1进行分型的小麦的基因型(CC基因型、CA基因型和AA基因型)时，按照如下方法进行鉴定：根据PCR产物A的序列确定小麦的基因型，PCR产物A的第646位为A的小麦为AA基因型小麦；PCR产物A的第646位为C的小麦为CC基因型小麦；PCR产物A的第646位为A和C的小麦命名为CA基因型小麦。二、dCAPS-7D-SNP1和CAPS-7D-SNP2与小麦产量相关性状相关选取262份六倍体小麦组成自然群体1(表2)，采用步骤一中的鉴定小麦基因型的方法对自然群体1进行基因型分型，并对基因型与株高和千粒重两个个产量相关性状进行关联分析。1、基因型的确定1)提取待测小麦的基因组DNA，用利用引物对P进行PCR扩增，得到PCR产物A；利用引物对P进行PCR扩增的体系(15μL)为：ddH2O8.0μL、5×PCRbuffer3.0μL、引物p1(5μmol/L)和p2(5μmol/L)各0.6μL、dNTPs(2.5μmol/L)0.4μL、transfastpfu酶(5U)0.3μL、基因组DNA(20ng/μL)2.1μL。PCR扩增条件为:95℃5min；95℃30s,59℃30s,72℃30s,35次循环；72℃10min；4℃保存。2)以稀释100倍的PCR产物A为模板，采用引物对Q进行PCR扩增，得到PCR产物B；采用引物对Q进行PCR扩增的体系(10μL)为：ddH2O2.8μL、2×TaqPCRMasterMix5.0μL、引物q1(5μmol/L)和q2(5μmol/L)各0.6μL、稀释100倍的PCR产物A1μL。PCR扩增条件为:95℃5min；95℃30s,60℃30s,72℃30s,33次循环；72℃10min；4℃保存。3)对PCR产物A进行测序，根据PCR产物A的序列对自然群体1中的各小麦植株进行基因型分型，结果如表2所示。4)用足量的限制性内切酶BamHⅠ酶切PCR产物A，使PCR产物A与BamHⅠ充分反应，得到酶切产物A，用足量的限制性内切酶AvaⅡ酶切PCR产物B，使PCR产物B与AvaⅡ充分反应，得到酶切产物B，电泳检测酶切产物A和酶切产物B，利用步骤一中的方法根据酶切产物A和酶切产物B的DNA片段数和大小确定待测小麦的基因型(图1中b和c)，对于酶切产物A和酶切产物B均为三条DNA片段的小麦，将该待测小麦的PCR产物A进行测序确定其基因型，结果显示利用该方法得到的基因分型结果与步骤3)中的基因型分型结果一致。采用限制性内切酶BamHⅠ处理PCR产物A的体系为：10×digestbuffer1.0μL、BamHⅠ0.3μL、PCR产物A4.0μL、ddH2O4.7μL。采用限制性内切酶AvaⅡ处理PCR产物B的体系为：10×digestbuffer1.0μL、AvaⅡ0.3μL、PCR产物B4.0μL、ddH2O4.7μL。酶切条件均为37℃孵育4-6h。2、基因型与产量相关性状的关联分析在成熟期，统计在北京种植的表2的各个小麦品种的株高和千粒重(表2)。用Tassel2.1软件利用GLM模型对小麦的基因型与株高和千粒重性状进行关联分析。表2、自然群体1各个小麦基因型及平均株高和平均千粒重的统计结果注：“-”表示无PCR产物，“/”表示无结果。表3、小麦自然群体1中三种基因型的产量相关性状统计结果性状A1A1A2A2A3A3株高(cm)79.66±2.41B93.23±2.79A86.43±1.56AB千粒重(g)37.17±0.78A34.42±0.81B34.13±0.43B注：大写字母代表不同基因型小麦之间性状差异极显著(P<0.01)。结果发现，A1A1基因型小麦的千粒重极显著地(P<0.01)高于A2A2基因型和A3A3基因型小麦的千粒重，A2A2基因型小麦的千粒重与A3A3基因型小麦的千粒重没有显著差异；A2A2基因型小麦的株高极显著地(P<0.01)高于A1A1基因型小麦的株高，A1A1基因型与A3A3基因型小麦、A2A2基因型与A3A3基因型小麦的株高差异均未达到极显著水平(表3)。表4、小麦自然群体1中dCAPS-7D-SNP1与产量相关性状分析表5、小麦自然群体1中CAPS-7D-SNP2与产量相关性状分析结果显示，所有A2A2与A3A3基因型小麦的千粒重显著小于A1A1基因型小麦的千粒重(即CC基因型的小麦的千粒重显著小于AA基因型的小麦的千粒重)，所有A2A2基因型与A3A3基因型小麦的株高显著大于A1A1基因型小麦的株高(即CC基因型的小麦的株高显著大于AA基因型的小麦的株高)(表4)。所有A1A1和A3A3基因型小麦的株高与A2A2基因型小麦的株高相比无显著差异(即CAPS-7D-SNP2为C基因型的小麦的株高与CAPS-7D-SNP2为T的小麦的株高相比无显著差异)，所有A1A1与A3A3基因型小麦的千粒重与A2A2基因型小麦的千粒重没有显著差异(即CAPS-7D-SNP2为C基因型的小麦的千粒重和CAPS-7D-SNP2为T基因型的小麦的千粒重没有显著差异)(表5)。说明本发明中的dCAPS-7D-SNP1的核苷酸以及A1A1基因型、A2A2基因型和A3A3基因型与小麦的株高和千粒重相关，能够在选育小麦具有优异产量性状中起作用。当前第1页1 2 3