专利名称：利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法。
背景技术：
转基因技术是利用异源基因进行种质资源创新的良好途径，但转化效率低下是限制转基因技术在小麦上应用的世界性难题。迄今为止，已报道的小麦转基因方法主要有花粉管法、基因枪法和农杆菌介导法。其中，花粉管法是利用小麦花粉萌发形成的花粉管通道，将外源基因导入受体。该项技术不需要愈伤组织的培养过程，相比于基因枪法既简单又经济，但因其重复性差，很难获得分子证据，在小麦上的应用越来越少。基因枪法是以金粉或钨粉作为载体，通过高压轰击受体组织将外源基因导入到受体细胞中，并实现基因整合。但基因枪法除了需要消耗昂贵的大载体、可裂膜、阻挡网等一次性耗材外，插入到受体细胞中的基因往往是随机整合，并且是多拷贝插入。因为小麦是异源六倍体，基因组非常庞大，多拷贝插入除了影响基因的表达效率外，转基因后代纯合较慢，难以迅速获得纯合株系。另夕卜，筛选标记难以去除也是限制基因枪转化小麦的主要因素之一。农杆菌法则克服了上述两种方法的缺点，其原理是先用目标基因替换根癌农杆菌上的致癌基因，在农杆菌侵染受体材料时，目标基因被释放整合进入受体细胞，这种插入往往以单拷贝或低拷贝的形式发生，而且作为质粒复制所需要的筛选标记被留在受体细胞外，提高了转基因的安全性。
农杆菌介导法的上述优点，赋予它具有极大的应用潜力。但是农杆菌的天然寄主是双子叶植物，对许多单子叶植物侵染困难。近年来，通过科学家的不断努力，水稻、玉米、小麦等重要的单子叶植物的转化相继成功。就水稻而言，以明恢63成熟胚愈伤组织为受体的农杆菌转化，其效率已经达到90%。而农杆菌转化小麦效率低下仍然是一世界性难题。目前，通过农杆菌介导进行转化的方法主要有两种:一是农杆菌侵染幼胚、成熟胚及其诱导形成的愈伤组织，通过后续的愈伤诱导、筛选和再生获得转基因小麦，但农杆菌侵染后的愈伤组织，往往因为农杆菌的毒性而褐变，无法继续生长，造成转化效率低下。二是茎尖分生组织侵染法，即利用农杆菌侵染创伤的茎尖分生组织，不经过愈伤组织的筛选过程，直接收获种子，然后对获得的后代进行筛选和鉴定。在这个转化过程中，因为茎尖是一个高度分化的器官，其中只有部分细胞被转化，因此，转化体为转化细胞与非转化细胞共存的嵌合体，而且转化细胞最终发育成为可遗传器官的几率微乎其微。因此，单纯的茎尖转化法在转化当代(Ttl代)检测的阳性比率高达75 %，但是在T1代中的比率极少。发明内容
本发明的目的是 提供一种培育转基因小麦的方法，包括通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞的步骤，所述方法包括如下步骤:
I)将含有目的DNA表达载体的重组农杆菌接种于胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中，培养所述露白小麦种子获得处于雌雄蕊分化期的幼穗；
2)取步骤I)得到的处于雌雄蕊分化期的幼穗进行离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织，得到所述转基因小麦。
在上述方法中，步骤I)中所述接种是在所述胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中注入I U L所述含有目的DNA表达载体的重组农杆菌菌液。
在上述方法中，所述重组农杆菌菌液的0D_为0.6。
在上述方法中，所述重组农杆菌菌液中含有乙酰丁香酮0.4mmol/L0
在上述方法中，所述农杆菌可为根癌农杆菌，具体可为根癌农杆菌EHA105。
在上述方法中，步骤2)中所述离体脱分化按照包括如下步骤的方法进行:将所述处于雌雄蕊分化期的幼穗接种于脱分化培养基中培养，获得愈伤组织。
在上述方法中，步骤2)中所述离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织后，还包括将所述含有所述目的DNA的愈伤组织接种于分化培养基中培养，获得具有根茎叶的小麦植株的步骤。
在上述方法中，所述脱分化培养基和所述分化培养基的基础培养基为MS培养基。
在上述方法中，所述脱分 化培养基中含2.5mg/L 2，4_D和/或150mg/L特美汀和/或筛选转化体的抗生素，PH值为5.8 ;所述分化培养基中含2mg/L KT和/或筛选转化体的抗生素，pH值为5.8。
在上述方法中，所述分化培养基中培养的光照条件为:连续光照，所述连续光照的光照强度为1500LUX。
本发明将幼穗拯救法与萌发种子转化法相结合获得转基因小麦，转化效率达到12%。本发明的方法既克服了一般茎尖转化法形成嵌合体的问题，又解决了农杆菌直接侵染小麦幼胚、幼穗、成熟胚等所造成的组织褐化死亡问题，对小麦品种的遗传改良和种质创新具有十分重要的意义。
图1为农杆菌侵染所用的小麦露白种子。
图2为共培养三天后种子的萌发生长情况。
图3为转化后Gus基因在Ttl代转化植株中的嵌合表达。
图4为转化后Gus基因在Ttl代转化植株根部的表达。
图5为幼穗拯救适宜的小麦幼穗大小。
图6为幼穗拯救过程中愈伤组织的切块培养。
图7为用于分化再生的胚性愈伤组织。
图8为Ttl代转基因植株的PCR检测。其中，I为分子量标准DL2000，从上到下依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;2_16 为部分 Ttl 代转基因植株；17 为质粒PCAMBIA2301 (阳性对照);18为非转基因植株(阴性对照)。
图9为Ttl代转基因植株中Gus基因在根部的表达情况。其中，左侧的2个为非转基因阴性对照，右侧的2个为Ttl代转基因阳性植株。
图10为Ttl代转基因植株中Gus基因在叶子中的表达情况。左侧的2个为Ttl代转基因阳性植株，右侧的2个为非转基因阴性对照。
图11为Ttl代转基因植株中Gus基因在籽粒中的表达情况。左侧的2个为Ttl代转基因阳性植株，右侧的I个为非转基因阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验所用的质粒pCAMBIA2301 (GenBank AF234316，其部分序列见序列表序列3)和根癌农杆菌EHA105 (Agrobacterium tumefaciens)均购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。质粒DNA和转基因小麦基因组DNA的提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素、抗生素、激素以及Gus染色所需的药品均购自Sigma-Aldrich中国公司。
用于进行基因转化的小麦品系为K35(隋新霞，黄承彦，楚秀生，李根英，樊庆琦.易花药培养的早熟小麦新种质K35.山东农业科学，2007年第一期，116-117页)，公众可从山东省农业科学院作物研究所和中国农业科学院作物科学研究所获得。
YEP液体培养基:胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，用水定容，pH值为7.0。
YEP固体培养基:在上述 YEP液体培养基中添加琼脂7g/L。
MS培养基的溶质见表1，溶剂为超纯水，调节pH值为5.8，再按7%的质量百分比添加琼脂后制成固体培养基。
表1.MS培养基的溶质及其浓度
权利要求
1.培育转基因小麦的方法，包括通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞的步骤，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 1)将含有目的DNA表达载体的重组农杆菌接种于胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中，培养所述露白小麦种子获得处于雌雄蕊分化期的幼穗； 2)取步骤I)得到的处于雌雄蕊分化期的幼穗进行离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织，得到所述转基因小麦。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)中所述接种是在所述胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中注入I y L所述含有目的DNA表达载体的重组农杆菌菌液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述重组农杆菌菌液的OD_为0.6。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述重组农杆菌菌液中含有乙酰丁香丽 0.4mmol/L0
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述农杆菌为根癌农杆菌。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述离体脱分化按照包括如下步骤的方法进行:将所述处于雌雄蕊分化期的幼穗接种于脱分化培养基中培养，获得愈伤组织。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织后，还包括将所述含有所述目的DNA的愈伤组织接种于分化培养基中培养，获得具有根茎叶的小麦植株的步骤。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述脱分化培养基和所述分化培养基的基础培养基为MS培养基。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述分化培养基中培养的光照条件为:连续光照，所述 连续光照的光照强度为1500LUX。
全文摘要
本发明公开了一种利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法。该方法通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞，包括如下步骤1)将含有目的DNA表达载体的重组农杆菌接种于胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中，培养所述露白小麦种子获得处于雌雄蕊分化期的幼穗；2)取步骤1)得到的处于雌雄蕊分化期的幼穗进行离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织，得到所述转基因小麦。本发明将幼穗拯救法与萌发种子转化法相结合获得转基因小麦，转化效率可达12％。本发明的方法既克服了一般茎尖转化法形成嵌合体的问题，又解决了农杆菌直接侵染小麦幼胚、幼穗、成熟胚等所造成的组织褐化死亡问题，对小麦品种的遗传改良和种质创新具有十分重要的意义。
文档编号C12N15/82GK103205455SQ201210006728
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者李根英, 夏先春, 李玉莲, 高洁, 宋国琦, 宋华东, 何中虎, 黄承彦, 樊庆琦, 隋新霞, 楚秀生 申请人:山东省农业科学院作物研究所, 中国农业科学院作物科学研究所