专利名称：识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到能识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列，特别涉及到对炭疽芽胞杆菌芽孢特异性检测和鉴别的多肽序列。本发明也提供了应用含有该序列的多肽和蛋白质，用于炭疽芽胞杆菌芽孢鉴别与检测的方法。
背景技术：
炭疽是严重威胁人类健康的传染性疾病，其病原体为炭疽芽胞杆菌。炭疽芽胞杆菌的芽孢因其极大的抗逆性和生物毒性，是备受关注的生物战剂和生物恐怖原之一。由于炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌以及蕈状芽胞杆菌非常近缘，从而给炭疽芽孢的有效鉴别与快速检测带来困难。发展能特异性识别并具有高亲和力的生物标志物用于炭疽芽胞杆菌芽孢的检测与鉴定具有重要意义。到目前为止，有许多炭疽芽孢的检测生物标志物被发现。其中包括针对炭疽芽抱表面保护性抗原的抗体(Long, G. W. and Τ. O 1 Brien (1999). " Antibody-based systems for the detection of bacillus anthracis in environmental samples. " J_ Appl Microbiol 87(2) :214. ；C ote，C. K.，C. A. Rossi，et al. (2005). " The detection of protective antigen (PA)associated with spores of Bacillus anthracis and the effects of anti—PA antibodies on spore germination and macrophage interactions. " Microb Pathog 38 (5-6) :209-225. ；Wang, D. B.，L.J.Bi，et al. (2009). 〃 Label-free detection of B. anthracis spores using a surface plasmon resonance biosensor. " Analyst 134(4) :738-742.)，筛选出的单链抗体(Wang，S. Η·， J.B.Zhang,et al. (2006). 〃 Construction of single chain variable fragment (ScFv) and BiscFv-alkaline phosphatase fusion protein for detection of Bacillus anthracis. " Anal Chem 78(4) :997-1004.)，以及通过嗷菌体表面展示技术筛选出的多妝序列(Williams, D. D.，0. Benedek, et al. (2003). " Species-specific peptide ligands for the detection of Bacillus anthracis spores. 〃 Appl Environ Microbiol 69(10) :-6288-6293. ；Sainath Rao, S.，Κ. V. Mohan, et al. (2010). " Peptides panned from a phage-displayed random peptide library are useful for the detection of Bacillus anthracis surrogates B. cereus 4342 and B. anthracis Sterne. Biochem Biophys Res Commun 395(1) :93-98.)等等。但是目前的这些生物标志物往往对炭疽芽孢的特异性与亲和力不好。plyG是炭疽芽胞杆菌Y噬菌体产生的专一性裂解炭疽芽胞杆菌的裂解酶 (Schuch，R.，D. Nelson, et al. (2002). " A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. " Nature 418 (6900) :884-889.)。该酶具有一个酸胺酶活性区段，具有很高的杀菌活性和特异性，专一性的裂解炭疽芽胞杆菌，而对其它芽胞杆菌以及革兰氏阴性细菌没有作用。现有研究已找到在PlyG上含有一段氨基酸序列能特异性的识别炭疽芽胞杆菌的营养体(Fujinami，Y.，Y. Hirai, et al. (2007). " Sensitivedetection of Bacillus anthracis using a binding protein originating from gamma-phage. " Microbiol TmMirioI 51(2) : 163-169.),但 plyG 上是否含有能识别炭疽芽胞杆菌芽孢的氨基酸序列还不知道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列。还提供含有该多肽序列的多肽和蛋白质，用于检测炭疽芽胞杆菌芽孢的探针，或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体的应用。本发明解决其技术问题采用以下的技术方案本发明提供的识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列，是一段能识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列SBDl，其氨基酸序列为NVRTHQSWSGKYCPH觀LAEG。所述多肽序列SBDl是通过体外截断炭疽芽胞杆菌Y噬菌体裂解酶plyG方法而获得。含有所述SBDl的多肽和蛋白质具有能特异识别炭疽芽胞杆菌芽孢的能力。含有所述SBDl的多肽和蛋白质直接用于检测或鉴定炭疽芽胞杆菌芽孢的探针， 或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体。所述SBDl与其它物质结合后，用于检测或鉴定炭疽芽胞杆菌芽孢的探针，或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体；所述其它物质为具有荧光的染料、酶或磁性颗粒等物质。在所述SBDl的基础上，可以通过增加plyG蛋白质上面的一些氨基酸序列，获得与炭疽芽胞杆菌芽孢具有更高亲和力的多肽序列SBD2，其氨基酸序列为DNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSWSGKYCPHRMLAEGRWGAFIQKVKNGNVATTSPT。所述SBD2直接用于检测或鉴定炭疽芽胞杆菌芽孢的探针，或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体。所述SBD2与其它物质结合后，用于检测或鉴定炭疽芽胞杆菌芽孢的探针，或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体；所述其它物质为具有荧光的染料、酶或磁性颗粒等物质。本发明有以下的主要突出效果和优点可用于检测炭疽芽胞杆菌芽孢的探针或者富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体。具有所发明的多肽序列的多肽能特异性的结合炭疽芽胞杆菌芽孢，而对炭疽芽胞杆菌的营养体没有识别作用，对其它种类细菌的芽孢也没有识别作用。该多肽与具有荧光的染料、酶或磁性颗粒等物质结合后，仍保持其对炭疽芽胞杆菌芽孢的特异结合。这种特异性的识别和结合能够用于炭疽芽胞杆菌芽孢的鉴定和检测。
图I为FITC荧光标记的SBD多肽对炭疽芽胞杆菌芽孢染色的显微镜图像。图2为FITC荧光标记的SBD多肽对炭疽芽胞杆菌芽孢特异性识别的统计图。图3为FITC荧光标记的SBD多肽和单独的FITC对炭疽芽胞杆菌营养体识别的荧光图。图4为绿色荧光蛋白标记的含plyG酶上60个氨基酸序列的蛋白质EP6对炭疽芽胞杆菌芽孢染色的图像。
图5为FITC-SBD多肽与EP6对炭疽芽胞杆菌芽孢亲和力差异的比较图。图6为FITC-SBD多肽与炭疽芽胞杆菌芽孢之间亲和力测定结果的曲线图。图7为EP6蛋白质与炭疽芽胞杆菌芽孢之间亲和力测定结果的曲线图。图8为EP6蛋白质荧光消减法检测炭疽芽孢结果图。图9为用流式细胞术检测炭疽芽孢结果图。图10为用夹心ELISA法检测炭疽芽孢结果的曲线图。
具体实施例方式本发明公开了一段能识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽，该多肽序列通过体外截断炭疽芽胞杆菌Y噬菌体裂解酶PlyG而获得。本发明的内容还涉及到在此序列基础上，通过增加一些在plyG酶上的氨基酸序列后，获得对炭痕芽胞杆菌芽抱具有更闻未和力的氣基酸序列。本发明还公开了通过化学合成或基因工程方法构建一系列含有该序列的多肽和蛋白质，用于检测炭疽芽胞杆菌芽孢的探针或者富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体的方法。下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。下列实施例中所用的方法如无特别说明均是常规的实验方法。实验中所用到的引物均委托上海英骏公司合成。测序均由上海英骏公司完成。多肽的合成与标记委托上海强耀科技有限公司合成。试验中用到的全长PlyG基因序列委托上海生工合成，用到的所有菌株和载体均为申请者实验室保存。实施例I.能识别炭疽芽孢的NVRTHQSWSGKYCPH觀LAEG多肽(SBDl)的获得之前公开的plyG蛋白质的全长序列如下MEIQKKLVDPSKYGTKCPYTMKPKYITVHNTYNDAPAENEVSYMISNNNEVSFHIAVDDKKAIQGIPLE RNAffACGDGNGSGNRQSISVEICYSKSGGDRYYKAEDNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSffSGKYCPHRMLAEGR WGAFIQKVKNGNVATTSPTKQNIIQSGAFSPYETPDVMGALTSLKMTADFILQSDGLTYFISKPTSDAQLKAMKEYL DRKGffffYEVK0通过体外截短plyG蛋白质实验，鉴定发现该蛋白质上面的21个氨基酸能识别炭疽芽胞杆菌芽孢，其中底部划线处为21个氨基酸所对应的多肽序列(SBDl)在噬菌体裂解酶plyG全长氨基酸序列上的位置。SBDl具有能与炭疽芽胞杆菌的芽孢结合的能力。为进一步证实该多肽序列与炭疽芽胞杆菌的芽孢结合的特异性与亲和力，采用化学方法，合成了在多肽N-端修饰有荧光素FITC标记的多肽(FITC-SBD)FITC-NVRTHQSffSGKYCPHRMLAEG，将FITC-SK)多肽溶于磷酸缓冲液PBS(137mM NaCl, 2. 7mM KC1，4. 3mMNa2HP04 ·Η20，
I.4mM KH2PO4,ρΗ7. 4)后，就可用于与炭疽芽胞杆菌的芽孢结合的能力的验证以及其它的检测试验。实施例2.SBDl多肽识别炭疽芽孢的验证(I)炭疽芽孢预处理
本实验中采用甲醛灭活的炭疽芽孢作为实验样本。灭活的炭疽芽孢用 PBSM(1 XPBS，5%脱脂牛奶)在 37°C封闭 2h，用 PBST (I XPBS, O. 05% Tween-20)通过离心 (12000g，lmin)洗涤3次后，溶于PBS中。(2)炭疽芽孢的染色及荧光显微镜分析将处理好的炭疽芽孢与同摩尔浓度的FITC-SBD和FITC在室温分别孵育 30min-lh，用 PBST(1XPBS，0. 05% Tween-20)通过离心(12000g, lmin)洗涤 3 次后，溶于磷酸缓冲液中。取适量与FITC-SBD孵育后的炭疽芽孢涂布在载玻片上，用荧光显微镜观测炭疽杆菌芽孢的荧光。同时，以FITC孵育的炭疽芽孢为对照，用荧光显微镜观测与FITC孵育后的炭疽杆菌芽孢的荧光。用FITC-SBD孵育成功后的炭疽芽孢在荧光显微镜下呈现明亮的绿色(图I)，而与FITC孵育的炭疽芽孢在荧光显微镜下只有很微弱的背景荧光。证明 FITC-SBD具有能与炭疽芽孢结合的能力。(3) FITC-SBD对炭疽芽孢特异性的确定(3. I)对照芽孢的准备取适量的蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌以及枯草芽胞杆菌的芽孢，用PBSM(1XPBS，5%脱脂牛奶)在37°C封闭2h，用 PBST(I XPBS,O. 05 % Tween-20)通过离心(12000g，lmin)洗涤 3 次后，溶于 PBS 中。同时取适量的炭疽芽胞杆菌营养体，用PBSM(1XPBS，5%脱脂牛奶)在37 °C封闭2h，用 PBST (I X PBS, O. 05% Tween-20)通过离心(12000g，lmin)洗涤 3 次后，溶于 PBS 中。这些芽孢中的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌是与炭疽芽胞杆菌极为近缘的芽胞杆菌，它们之间的差别一般认为只在于其中所含有的细菌质粒有差别。之前公开的一些多肽很少有能区别这些近缘芽孢的能力。 (3. 2)染色及荧光显微镜分析将处理好的芽孢和营养体细胞与同浓度的FITC-SBD和FITC在室温分别孵育 30min-lh，用 PBST(1XPBS，0. 05% Tween-20)通过离心(12000g, lmin)洗涤 3 次后，溶于 PBS中。取适量孵育后的芽孢和营养体分别涂布于载玻片上，用荧光显微镜分别观测芽孢和营养体细胞的荧光。同时，分别以FITC孵育后的芽孢和营养体为对照，用荧光显微镜分别观测芽孢和营养体细胞的荧光。统计各类芽孢和营养体分别用FITC-SBD、FITC以及PBSB 染色后的荧光强度，并做统计分析。结果表明只有用FITC-SBD染色后的炭疽芽孢呈现出明显的荧光强度的增加，而其它芽孢在荧光强度上均没有明显的变化(如图2所示)。此外， 也发现FITC-SBD不能与炭疽杆菌营养体结合(如图3所示)。该实验证实该多肽序列组成的FITC-SBD多肽对结合炭疽芽胞杆菌的芽孢具有很好的特异性，能区别炭疽芽孢与其它菌的芽孢的同时，也能区别炭疽芽孢与炭疽杆菌营养体。实施例3.含有更长plyG氨基酸序列的识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽获得在SBDl序列上，通过增加更多的plyG上的氨基酸序列，有可能得到更好的能识别炭疽芽孢的多肽。本实施例仅举一列来说明。在该例子中，通过将绿色荧光蛋白质(EGFP) 基因与PlyG基因中含有所感兴趣的多肽基因片段融合，再通过大肠杆菌表达后，成为带有荧光蛋白质标记的多肽。采用该荧光蛋白质标记后的多肽用于炭疽芽胞杆菌芽孢的识别。
本实施例以融合有一个长60氨基酸序列(106-165，p60)的多肽和EGFP的融合蛋白质EP6为例子。MEIQKKLVDPSKYGTKCPYTMKPKYITVHNTYNDAPAENEVSYMISNNNEVSFHIAVDDKKAIQGIPLE RNAffACGDGNGSGNRQSISVEICYSKSGGDRYYKAEDNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSffSGKYCPHRMLAEGR ffGAFIQKVKNGNVATTSPTKQNIIQSGAFSPYETPDVMGALTSLKMTADFILQSDGLTYFISKPTSDAQLKAMKEYL DRKGffffYEVK0上述多肽序列为之前报道的全长plyG蛋白的序列，其中底部划线处为识别炭疽芽胞杆菌芽孢的氨基酸序列P60在plyG蛋白序列上的位置。该多肽序列为能更好的识别炭疽芽孢的多肽序列SBD2。(I)以plyG基因为模板扩增p60片段。在目的基因的两端分别加入EcoRI和XhoI的酶切位点，引物设计如下Upper 5~TAAAGAATTCGATAATGCTGTTGATGTTG~3EcoRI ,Down 5~TAATCTCGAGTTATGTTGGTGAAGTAGTCG~3XhoI以2μ I基因为模板，各加入引物I μ g进行PCR扩增，PCR扩增程序如下1)94°C, 5min ；2) 94°C, 30sec, 52°C, 30sec, 72°C, 30sec, 30 个循环;3) 72 °C，IOmin ； (2)将 p60 基因连入表达质粒pET28a (+)得到重组载体pET-p60，然后将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)。(3)表达载体pET-EP6的构建。以绿色荧光蛋白基因载体pEGFP-Cl (申请者实验室保存)为模板扩增egfp基因， 并在引物两端引入NdeI和BamHI的酶切位点，引物设计如下Upper 5~AATCCATATGGTGAGCAAGGGCGAG~3NdeI， Down 5~GGCCGGATCCCTTGTACAGCTCGTC~3BamHI，以2μ I基因为模板，各加入引物I μ g进行PCR扩增，PCR扩增程序如下1)94°C, 5min ;2) 94°C，30sec，52°C，lmin，72°C，lmin，30 个循环；3) 72°C, IOmin ;将产物进行凝胶电泳回收后连入载体pET-p60中得到表达载体PET-EP6，然后将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)。(4)EP6的表达纯化。将表达菌株BL21 (DE3) /pET_EP6用IPTG低温诱导表达。收集菌体后超声破碎，取上清过Ni-NTA柱，收集250mM咪唑洗脱峰，收集到的融合蛋白质EP6经PBS透析后，保存在 4摄氏度冰箱中备用。实施例4.EP6识别炭疽芽孢的验证(I)炭疽芽孢预处理本实验中采用甲醛灭活的炭疽芽孢作为实验样本。灭活的炭疽芽孢用 PBSM(1 XPBS，5%脱脂牛奶)在 37°C封闭 2h，用 PBST (I XPBS, O. 05% Tween-20)通过离心 (12000g，lmin)洗涤沉淀物3次后，溶于PBS中。(2)炭疽芽孢的染色及荧光显微镜分析
将处理好的炭疽芽孢与同摩尔浓度的EP6和EGFP在室温分别孵育30min_lh，然后用 PBST (I XPBS, O. 05% Tween-20)通过离心(12000g, lmin)洗涤 3 次后，溶于 PBS 缓冲液中。取适量与EP6孵育后的炭疽芽孢涂布于载玻片上，用荧光显微镜观测芽孢荧光。同时， 以与EGFP孵育后的炭疽芽孢为对照。用EP6孵育成功后的炭疽芽孢在荧光显微镜下呈现明亮的绿色(图4)，而作为对照的EGFP与芽孢孵育后，炭疽芽孢在荧光显微镜下只呈现微弱的背景荧光，证实在SBDl序列基础上，含有更多plyG蛋白质上序列的延长多肽与EGFP 融合的蛋白质EP6仍然可以与炭疽芽孢结合。实施例5.FITC-SBD与EP6对炭疽芽孢亲和力的测定亲和力常数是反应两个分子之间结合力强弱的重要参数之一，本实施例中通过比较同浓度的FITC-SBD和EP6分别与等量的炭疽芽孢在相同条件下作用后，测定离心上清中荧光强度的减少，来反应FITC-SBD和EP6与炭疽芽孢结合的相对强弱。同时采用Scatchard plot法测定了 EP6与炭疽芽孢结合的亲和力常数，来进一步的验证EP6与炭疽芽孢的结合。(I)FITC-SBD与EP6对炭疽芽孢结合差异的比较相同摩尔浓度的FITC-SBD与EP6分别与一定浓度的炭疽芽孢混合孵育30min后， 12000g离心Imin后，取上清测定荧光强度，通过荧光的减少来评价二者对炭疽芽孢结合力的差异。所得到的荧光消减柱状图见图5。结果反应EP6比FITC-SBD的结合能力更好。证实在SBDl序列的基础上，通过改造，有可能获得比SBDl多肽结合炭疽芽孢能力更好的多肽。(2) Scatchard plot法测定亲和力常数的实验过程将一定浓度的炭疽芽孢与不同浓度的EP6蛋白在37°C孵育2h，12000g离心lmin 后，取上清测定荧光强度，并将其转化为EP6的蛋白质摩尔浓度Cf。孵育前的EP6的摩尔浓度定义为Ct。由此可以计算出在孵育过程中结合到炭疽芽孢上的EP6的摩尔浓度Cb为 (Ct-Cf)。实验中所用到的炭疽芽孢的浓度定义为Cs。并据此定义反应的结合比例V = Cb/ Cs。根据Scatchard plot的原理，以v/Cf对V作图,所得到的直线的斜率的负倒数就是EP6 与炭疽芽孢结合的解离常数Kd，而直线与X轴的交点就是单个炭疽芽孢上存在的EP6的结合位点的个数。通过增加EP6的浓度，固定炭疽芽孢的浓度，得到的饱和曲线见图6，得到的 Scatchard plot直线见图7。并依据直线的回归方程(Adj. R2 = O. 9918)得到EP6与炭疽芽孢的解离常数为4. 42 X IO^7M.实施例6.消减法检测炭疽芽孢采用本发明所公开的多肽序列，可以构建各种探针，通过其特异性结合炭疽芽孢的特点，来发展各种检测炭疽芽孢的方法，如前面实施例中所用到的荧光显微镜法。还可以用于其它方法，如ELISA，流式细胞术，捕获富集后PCR的方法等等。本实施例采用荧光消减法作为例子。该方法的原理是将一定浓度的EP6与不同浓度的炭疽芽孢混合孵育，离心后测定上清中的荧光强度。通过孵育前后EP6荧光强度的变化来衡量炭疽芽孢的数量。该方法简单易行，对仪器要求不高，具有很好的重复性。具体步骤是(I)将一定浓度的EP6与不同浓度的炭疽芽孢按照I : I体积比混合，室温孵育30min-lh。(2) 12000g离心lmin，取上清测其荧光强度为Fb。其中孵育前EP6 的荧光强度为Fa。(3)以(Fa-Fb)对孢子浓度作图，得出检测的线性范围和标准曲线。⑷ 以蕈状芽胞杆菌的孢子为阴性样品，按同样的方法进行试验。(5)结合阴性样品的实验结果，计算出该方法对炭疽芽孢检测的灵敏度约为lxl05CFU/ml。检测结果的曲线如图8所示。 测定实际样本时，将同浓度的EP6与实际样本按I : I体积比混合，按上述同样的步骤，测定孵育前后的荧光变化值(Fa-Fb)，同对照标准曲线，即可计算出实际样本中含有的炭疽芽孢数量。实施例7.流式细胞术检测炭疽芽孢将FITC-SBD1或EP6与不同浓度的炭疽芽孢混合，在PBS溶液中，室温孵育 30min-lh后，可以直接通过流式细胞仪，对标记上带有荧光的炭疽芽孢数目进行统计，达到快速检测溶液中炭疽芽孢的目的。本实施例中采用EP6作为荧光标记物和贝克曼FACSCalibur流式细胞仪，设定液流速度为lml/min, 15mff IS离子激光器的激发波长设定为488nm,检测所用的是530±15nm 的滤光片。按照仪器推荐的实验手册开展试验。由于EP6对炭疽芽孢具有很高的特异性， 所以该方法具有很低的背景，可以实现低至5xl03CFU/ml炭疽芽孢的检测。对不同浓度炭疽芽孢的检测结果如图9所示。实施例8.酶联免疫吸附法(ELISA)法检测炭疽芽孢本实施例中，将SBDl和SBD2分别与辣根过氧化物酶(HRP)偶联后，用于检测捕获到包被有炭疽芽孢抗体的96孔板上的芽孢，建立一种类似夹心ELISA法检测炭疽芽孢的方法。一抗可以是抗炭疽芽孢的单链抗体，也可以是抗炭疽芽孢的多抗。如果样本中有炭疽芽孢，芽孢会捕获在96孔板上，标记有HRP的SBDl或SBD2与捕获的芽孢反应后，经过洗涤后，会留在96孔板上，最后加入酶标抗体的底物后，就会显色。实验条件简单易控，具有很好的灵敏度。以下以SBDl与HRP偶联用于ELISA进行具体说明。(8. DSBDl与HRP的偶联SBD1与HRP偶联标记采用简易过碘酸钠法，该法是以 NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与SBDl上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高。具体步骤如下(I)称取5mg HRP溶解于Iml蒸馏水中。(2)于上液中加入O. 2ml新配的O. IM NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜。(4)加20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9. O 9. 5， 然后立即加入IOmg SBD在Iml O. OlM碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加O. Iml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4°C 2小时。(6)将上述溶液装入透析袋中，对O. 15M pH7. 4PBS透析，4°C过夜。(8. 2)包被抗体到96孔酶标板(购自Thermo Scientific)上:在每个孔中，加入实验室自制的100 μ I炭疽芽孢单克隆抗体(10 μ g/ml溶解于O. 5M碳酸缓冲液)，4°C孵育过夜，洗涤5次后，用含有5% (w/v)脱脂奶粉的TBS缓冲液37°C封闭2h。(8. 3)将含有炭疽芽孢的100 μ L样本溶液依次加入每个孔中，37°C反应Ih后，用TBS缓冲液洗涤3次。(8. 4)将标记有HRP的SBDl的溶液IOOyL加入每个孔中，37°C反应Ih后，用TBS 缓冲液洗涤3次。(8. 5)加入自制的TMB显色液100 μ L，室温反应O. 5h后，加入2M H2SO4中止反应， 用酶标仪(Bio-Tec Instruments, Inc.)测溶液在405nm的吸收。采用同样的步骤，SBD2与HRP偶联后也具有很好的识别能力。由于SBD2比SBDl 的亲和力强，也显示出了更好的灵敏度。对不同浓度炭疽芽孢的检测结果如图10所示。实施例9.磁珠免疫富集-PCR法检测炭疽芽孢本实施例中，将SBDl和EP6与羧基修饰后的磁珠偶联后，用于富集样品中的炭疽芽孢后，加热裂解，然后用PCR引物进行扩增，达到即特异又高灵敏检测的目的。SBDl和EP6偶联磁颗粒的制备方法如下使用含O. I % (体积/体积)Tween20的 50mM、pH4. 7的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使其终浓度均为20mM，室温反应一小时。洗涤磁珠后，分别加入SBDl和EP6使其与磁颗粒含有的羧基的数量比例是I : 300 到I : 400，37°C摇床120rpm反应2小时，洗涤磁颗粒后加入含有5% (质量/体积)BSA的 O. 02M PBS (pH7. 2)溶液，37°C摇床120rpm封闭2小时，使用含O. 1% (体积/体积)Tween20 的50mM、pH4. 7的醋酸钠缓冲液反复洗涤磁颗粒，并将分别偶联有SBDl和EP6的磁颗粒转移至含I % (质量/体积)PVP、I % (质量/体积)BSA、0· 5 % (体积/体积)Tween20,5% (质量/体积)蔗糖的50mM pH8. 5硼酸缓冲液中保存，置于4°C备用。取制备好的磁珠10 μ 1，与500 μ I的含炭疽芽孢的溶液混合，30°C反应O. 5-1小时后，在磁力架上进行磁颗粒分离，去掉溶液，用PBS洗涤磁珠3次，最后加入蒸馏水50 μ 1，然后在沸水浴中煮沸30-45min，IOOOOg离心Imin后取上清5_10 μ I用于PCR扩增。PCR 扩增采用购买的 Bacillus anthracis PCR 检测试剂盒(Takara, Cat. #RR027)，分别扩增炭疽芽孢的PA基因和CAP基因。PA引物序列为:PA7 5/ -ATCAC CAGAG GCAAG ACACC C-3'；PA6 5/ -ACCAA TATCA AAGAA CGACG C-3'。CAP引物序列为MOll 5/ -GACGG ATTAT GGTGC TAAG-3'；M012 5/ -GCACT GGCAA CTGGT TTTG-3'。PCR 扩增程序如下l)94°C,5min ；2)94°C, 15sec,60°C, 15sec, 72°C, 30sec, 35 个循环；3)72°C, IOmin ；PCR完成后，通过电泳检测是否有特异的DNA条带出现，就可以判断样本中是否有炭疽芽孢。实验结果表明，使用EP6修饰的磁珠能显著的提高富集炭疽芽孢的能力，使得 PCR可以对溶液中含有低至l-100CFU/ml炭疽芽孢的样本进行检测，SBDl修饰的磁珠具有相同的效果。
权利要求
1.一种识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列，其特征是一段能识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列SBD1，其氨基酸序列为NVRTHQSWSGKYCPH觀LAEG。
2.根据权利要求1所述的识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列，其特征是所述多肽序列 SBDl是通过体外截断炭疽芽胞杆菌Y噬菌体裂解酶plyG方法而获得。
3.权利要求1或2所述识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列的用途，其特征在于含有所述SBDl的多肽和蛋白质具有能特异识别炭疽芽胞杆菌芽孢的能力。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于含有所述SBDl的多肽和蛋白质直接用于检测或鉴定炭疽芽胞杆菌芽孢的探针，或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述SBDl与其它物质结合后，用于检测或鉴定炭疽芽胞杆菌芽孢的探针，或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体；所述其它物质为具有荧光的染料、酶或磁性颗粒物质。
6.权利要求I或2所述识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列的用途，其特征是在所述 SBDl的基础上，通过增加plyG蛋白质上面的一些氨基酸序列，获得与炭疽芽胞杆菌芽孢具有更高亲和力的多肽序列SBD2，其氨基酸序列为DNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSWSGKYCPHIMLAEGRWGAFIQKVKNGNVATTSPT。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征是所述SBD2直接用于检测或鉴定炭疽芽胞杆菌芽孢的探针，或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征是所述SBD2与其它物质结合后，用于检测或鉴定炭疽芽胞杆菌芽孢的探针，或者作为富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体；所述其它物质为具有荧光的染料、酶或磁性颗粒物质。
全文摘要
本发明涉及一种识别炭疽芽胞杆菌芽孢的多肽序列及其应用，具体是公开了一段能识别炭疽芽胞杆菌芽孢的NVRTHQSWSGKY CPHRMLAEG氨基酸序列；在此氨基酸序列基础上，增加一些在plyG酶上的氨基酸序列后，能获得对炭疽芽胞杆菌芽孢具有更高亲和力的多肽；通过化学合成或基因工程方法构建一系列含有该序列的多肽和蛋白质，可用于检测炭疽芽胞杆菌芽孢的探针或者富集炭疽芽胞杆菌芽孢的载体。具有所发明多肽序列的多肽的主要特征为能特异性结合炭疽芽胞杆菌芽孢，而对炭疽芽胞杆菌的营养体没有识别作用，对其它种类细菌的芽孢也没有识别作用，这种特异性的识别和结合能够用于炭疽芽胞杆菌芽孢的鉴定和检测。
文档编号C12R1/07GK102586214SQ20121000622
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者危宏平, 张先恩, 杨航, 王殿冰 申请人:中国科学院武汉病毒研究所