专利名称：小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用pcr引物组合及pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种生小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合，同时还涉及一种使用该引物的实时荧光定量PCR方法，属于生物检测技术。
背景技术：
黄嘌呤氧化酶(XO)是体内核酸代谢中一种重要的酶，该酶广泛分布于人体心、肺、肝脏、小肠粘膜等组织细胞浆膜内，血清中的XO主要来自于肝细胞。黄嘌呤氧化酶是一种专一性不高，既能催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进而生成尿酸，又能直接催化黄嘌呤生成尿酸的酶。底物专性较广，除以嘌呤衍生物为电子供体外，还可以蝶啶衍生物、醛(生成羧酸)为电子供体，表面上生成羟基化合物，氧原子来源于水。电子受体很多，有分子氧、硝酸盐、苯醌、硝基化合物、NAD、铁氧还蛋白等，但依酶的来源而有所不同。在反应时生成过氧化物， 引起连锁反应。以往的对黄嘌呤氧化酶的研究主要集中在该酶的序列、结构、功能、活性以及其抑制物上，中国专利公报公开了一种申请号为02827205. 6的发明专利，公布了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，而对于黄嘌呤氧化酶转录水平研究上缺乏有效的工具。实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量。实时荧光定量PCR可以对极微量的DNA模板进行准确定量，因其精度高，时间短而被广泛的应用。目前国内外还未见对黄嘌呤氧化酶转录水平定量方法的研究。为了研究小鼠体内黄嘌呤氧化酶的转录水平，需要建立一种能够精确对黄嘌呤氧化酶mRNA定量的方法，进而为研究黄嘌呤氧化酶功能及其影响因素打下基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合，以在转录水平上对黄嘌呤氧化酶进行定量。同时，本发明的目的还在于提供一种使用该PCR引物组合的实时荧光定量PCR方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合，该核苷酸序列为正向5，-TATGGCCCCGAGGTAAAAAC-3，反向5，-GGGCGGCCTGTCTTGTATGC-3”。本发明的技术方案还采用了一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量黄嘌呤氧化酶转录水平。所述的扩增序列为tatggccccgaggtaaaaatcgagaaaggagatctcaagaaaggcttttctgaagctgacaatgttgtctcaggagaattatatattggtggccaggagcacttctatctggagacccactgcaccattgccgtgccgaaaggcgaggcaggcgagatggagctcttcgtgagcacacagaacaccatgaaaacccagagctttattgcaaagatgttgggtgttccagacaacagaattgtagtccgagtgaaaagaatgggtggaggctttggagggaaggagacccggagcactctgatatccacagcagtggccttggctgcatacaagacaggccgccc所述的PCR扩增体系为25 μ L体系2 X SYBRMix 12. 5 μ L，10 μ mol/L正向、反向 引物各 O. 5 μ L，cDNA 模板 2 μ L，9. 35 μ L 去离子水，TaqDNAPolymerase O. 15 μ L，三步法对样品进行扩增，在荧光定量PCR仪上获取CT值。所述的三步法为95°C3min,95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 31sec，40 个循环。本发明应用实时荧光定量PCR方法对黄嘌呤氧化酶转录水平定量方法进行研究，通过黄嘌呤氧化酶序列设计特异引物，从而建立了快速、高效、准确的定量黄嘌呤氧化酶转录水平的方法。通过分析小鼠黄嘌呤氧化酶基因序列，设计特异引物，能够快速、精确的对黄嘌呤氧化酶转录水平定量。本发明的引物可以通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法来进行的DNA合成技术来获得，引物序列是在充分分析黄嘌呤氧化酶基因序列的基础上，因此对材料中非目的基因没有扩增信号。通过使用本发明的引物，对小鼠的黄嘌呤氧化酶转录水平实施定量，方法简单，精确。并且，分发明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，为研究小鼠黄嘌呤氧化酶功能以及其他因素对其影响提供了有效工具。实时荧光定量PCR25y L 体系(2XSYBRMix 12. 5 μ L，10 μ mol/L 正向、反向弓I物各 O. 5μ L，cDNA 模板 2μ L，9. 35μ L 去离子水，TaqDNAPolymerase O. 15μ L)，三步法(95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec,72°C 31sec，40个循环)对样品进行扩增,在荧光定量PCR仪上获取CT值。扩增结果可以通过与看家基因(如3-磷酸甘油醛脱氢酶基因等)比较，从而确定醛氧化酶的转录水平。计算公式如下醛氧化酶基因转录水平=2_'ctΔ CT = (CT. Target-CT. Actin) Time χ- (CT. Target-CT. Actin) Time 0.注CT. Target为黄嘌呤氧化酶基因CT值CT. Actin为看家基因CT值Time O为初始时间点数据Time χ为后期时间点数据使用本发明的引物以及方法进行黄嘌呤氧化酶转录水平定量样品主要为肝脏，但其他组织也可使用。
图I为XO目的片段的溶解曲线；图2为XO目的片段PCR扩增结果。图I、图2是荧光定量PCR特异性检测；图I中每条曲线代表不同小鼠的肝脏样品，图2中2-9，分别代表不同小鼠的肝脏样品。
具体实施例方式本实施例的小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合，该核苷酸序列为正向5，-TATGGCCCCGAGGTAAAAAC-3，反向5，-GGGCGGCCTGTCTTGTATGC-3”。下面是小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及PCR方法的具体实施例用于测定钥对小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平的影响I实验动物I. I. I实验动物的选择二月龄的清洁级ICR小白鼠60只。 I. I. 2实验动物的分组健康的雌性小白鼠40只和雄性小白鼠20只，适应5天后，随机分成4组，每组10只雌性和5只雄性小白鼠，雌雄分开饲养，自由采食，基础日粮相同，饮水中加入不同剂量的钥(以Na2Mo04 · 2H20形式)，分别是空白对照组、低钥组(IOOmg · L-1)、中钥组(200mg-L-1)、高钥组(400mg吨_1)，4周后雌雄合笼饲养。产仔后从每组仔鼠中随机雌性小白鼠30只和15只雄性小白鼠按原分组给予不同剂量的钥，8周后，再从每组中随机选取雌性小白鼠10只和5只雄性小白鼠合笼饲养。待其产仔。如此往复，使小鼠繁殖四代。每组取第三第四代二月龄小鼠各5只，眼球采血处死后，取肝脏组织置于样品保护剂中(Sampleprotector, TAKARA公司)用于黄嘌呤氧化酶转录水平的检测。I. 2实验方法1.2. I小鼠肝脏的采集小鼠眼球采血处死后，剪开腹腔，分离并摘取肝脏组织置于样品保护剂中(Sampleprotector, TAKARA公司)用于黄嘌呤氧化酶转录水平的检测。I. 2. 2目的基因的扩增、克隆、鉴定及测序I. 2. 2. 2总RNA的提取，参照说明书，步骤如下匀浆取约50 IOOmg新鲜小鼠肝脏组织，用DEPC处理过液氮预冷的研钵匀浆后，转移入I. 5mL的EP管中，加入ImLTRIPURE试剂，振摇片刻。RNA的分离孵育匀浆样品5min，使核酸充分裂解游离出来，每毫升TRIPURE试剂添加O. 2mL氯仿，盖上瓶盖，用手用力地摇晃EP管15sec，15 30°C下放置2 3min，1200g离心15min(2°C 8°C )分层下层为酚-氯仿，上层为水相，RNA存在于水相中。水相体积应为总体积的60%。RNA的沉淀吸取上层水相到一新I. 5mL的EP管内，留下有机相。用异丙醇沉淀RNA，与最开始加入TRIPURE量的比为2 1，15 30°C放置lOmin，1200g离心IOmin (2°C 8。。)。RNA在离心前是肉眼看不到的，离心后可在管底或侧壁上形成类似凝胶的滴状物。RNA漂洗去上清，用75%的乙醇漂洗RNA沉淀，与最开始加入TRIPURE量的比为I I。震荡混匀样品，2°C 8°C 7500g离心5min。干燥RNA :空气干燥或真空干燥5 IOmin。重溶RNA :将RNA溶解在20 μ I无RNA酶的DEPC水中，吹打几下，置于55 60°C lOmin，使其尽量溶解，贮于_70°C冰箱待用。I. 2. 2. 3琼脂糖凝胶电泳称取适量琼脂糖，用无菌TAE缓冲液配成I. 25%左右浓度，微波炉加热融化后，冷却并凝固，在用TAE缓冲液处理过的胶槽中电泳。电压为IOOV左右，在点样孔加入5 μ LRNA样品后进行电泳。当溴酚蓝跑到凝胶长度的2/3时停止电泳，将凝胶移至紫外灯上观察其完整性并拍照。用pharmacia biotech公司的核酸浓度测定仪测定RNA的浓度,初步估计提取RNA的质量，以确定反转录时所需要添加量。1.2.2. 4cDNA合成按试剂盒说明操作。在用DEPC处理过的无Rnase的200 μ LPCR管中进行目的基因cDNA的合成。I. 2. 2. 5目的基因引物的设计根据GenBank中收录的XO和3_磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的基因序列。利用引物设计软件Primer Express〗.O分别进行引物设计。其中GAPDH片段作为内参照。目的基因引物的设计如下(表I) 表I PCR 引物
权利要求
1.一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合，其特征在于该核苷酸序列为正向5’ -TATGGCCCCGAGGTAAAAAC-3’反向5’ -GGGCGGCCTGTCTTGTATGC-3”。
2.一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，其特征在于以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量黄嘌呤氧化酶转录水平。
3.根据权利要求2所述的小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，其特征在于所述的扩增序列为tatggccccgaggtaaaaatcgagaaaggagatctcaagaaaggcttttctgaagctgacaatgttgtctcaggagaattatatattggtggccaggagcacttctatctggagacccactgcaccattgccgtgccgaaaggcgaggcaggcgagatggagctcttcgtgagcacacagaacaccatgaaaacccagagctttattgcaaagatgttgggtgttccagacaacagaattgtagtccgagtgaaaagaatgggtggaggctttggagggaaggagacccggagcactctgatatccacagcagtggccttggctgcatacaagacaggccgccc
4.根据权利要求2所述的小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，其特征在于所述的PCR扩增体系为25ii L体系2X SYBR Mix 12. 5 y L，10 y mol/L正向、反向引物各 0.5iiL，cDNA 模板 2 ii L，9. 35 ii L 去离子水，TaqDNAPolymerase 0. 15yL，三步法对样品进行扩增，在荧光定量PCR仪上获取CT值。
5.根据权利要求4所述的小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，其特征在于所述的三步法为95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 31sec，40 个循环。
全文摘要
本发明涉及一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及其PCR方法，PCR引物组合的核苷酸序列为正向5’-TATGGCCCCGAGGTAAAAAC-3’反向5’-GGGCGGCCTGTCTTGTATGC-3”。本发明的引物可以通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法来进行的DNA合成技术来获得，引物序列是在充分分析黄嘌呤氧化酶基因序列的基础上，因此对材料中非目的基因没有扩增信号。通过使用本发明的引物，对小鼠的黄嘌呤氧化酶转录水平实施定量，方法简单，精确。并且，分发明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，为研究小鼠黄嘌呤氧化酶功能以及其他因素对其影响提供了有效工具。
文档编号C12N15/11GK102758003SQ201210006099
公开日2012年10月31日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者何万领, 尚泽松, 张才, 朱重伟, 杨自军, 王亚垒, 王宏伟, 王雪莹 申请人:河南科技大学