多个microRNAs复合检测的引物设计方法
【专利摘要】本发明属于法医学【技术领域】，具体涉及多个microRNAs复合检测的引物设计方法。本发明要解决的技术问题是通过检测miRNAs来确定体液斑痕的组织来源。本发明的技术方案是用于microRNAs检测的引物，包括特异性逆转录引物REP、上游引物PF和下游引物PR；所述的特异性逆转录引物REP从5’端到3’端方向依次包括接头序列ADP和P1，所述ADP从5’端到3’端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述P1为与待测miRNA标记3’末端互补的6～8个碱基。本发明建立了miRNA和法医DNA遗传标记的共平台检测，可对多个miRNAs复合扩增，由法医常见的微量检材得到更多组织来源信息，在法医遗传学领域具有显著的应用价值。
【专利说明】多个mi croRNAs复合检测的引物设计方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于法医学【技术领域】，具体涉及多个microRNAs复合检测的引物设计方 法。
【背景技术】
[0002] 法医物证鉴定通过对犯罪现场留下的生物性检材进行检测，可以得到对案件调查 有用的信息。法医生物检材与一般生物检材不同，犯罪现场多是一些体液斑痕，如血痕、唾 液斑、精液斑。确定这些体液斑痕的组织来源对明确案件性质有至关重要的作用，例如强奸 案中证明犯罪嫌疑人身上的体液斑是来源于受害者的阴道分泌物或月经血会使犯罪嫌疑 人难以将其解释为日常接触或物理攻击所形成。又如儿童性侵犯案件中，证明儿童内衣或 床单上的生物斑痕是来自精液会使案件性质更加明确。
[0003] 由于体液斑的组织来源鉴定在案件调查中的重要性，体液斑鉴定一直是法医学 研究的重点之一。早期的相关检测多采用基于血清学的方法，然而这些传统的体液斑检测 方法灵敏度各异，周期长，需要检材量大，一种试验只能分析一种体液，还会对检材造成破 坏而不能进行下游的实验，并不适合法医实际工作中常常遇到的微量和降解检材。也有学 者尝试用mRNA (200?300核苷酸）在组织中特异性表达的特征来进行体液鉴定，但由于其 扩增片段较大，在法医常见的高度降解和陈旧样本中检测成功率低。近年来，microRNA的 发现为体液斑组织来源问题的解决带来了新的希望。
[0004] microRNAs (miRNAs)属于一类非编码小RNA，长度约为18?25个核苷酸，它通过 特异性结合相应的mRNA，导致mRNA的断裂或者翻译抑制，在转录后水平对基因的表达进行 调控。与mRNA相比，miRNAs分子要小得多，理论上核酸分子越小越利于法医日常检案中常 见的高度降解和陈旧样本的检测。2006年，Pranidhi Sood等报道了 miRNAs具有细胞特异 性，2007年，Yu Liang等在BMC Genomics上发表了 miRNAs具有组织特异性的文章 ，miRNAs 因此成为疾病诊断、预后判断等方面的研究热点。由于miRNAs分子小，适于微量和降解检 材的检测，且其表达具有明显的组织特异性，因此miRNAs在体液斑痕组织来源的法医学鉴 定中具有独特的优势。2009年，Hanson等首次将miRNAs作为鉴定法医相关体液的标记用 于法医学研究。近年来，研究者运用实时定量PCR技术和基因芯片技术相继筛选出一些体 液特异性的miRNAs标记，可用于体液的组织来源鉴定。然而，实时定量PCR技术和基因芯片 技术在多数法医DNA实验室中并不是现有的常规技术。此外，在实际案件调查中，从犯罪现 场收集的检材有时是微量检材。法医相关分析常常需要对微量体液斑痕进行多种体液特异 性miRNAs标记的迅速检测，以判断体液斑究竟来源于何种组织。实时定量PCR技术和基因 芯片技术难以满足对法医微量生物性检材进行多个miRNAs标记同时快速检测的要求。因 此，建立适应法医学需要的检测技术，使基于特异性miRNAs的体液鉴定能在法医学实验室 中广泛推广应用是目前有待解决的新问题。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是实现多个miRNAs的复合检测以及miRNAs和DNA的共 平台检测，使基于特异性miRNAs的体液鉴定方法能在法医DNA实验室中广泛用于快速确定 体液斑痕的组织来源。
[0006] 本发明的技术方案是用于microRNAs检测的引物，包括特异性逆转录引物REP、上 游引物PF和下游引物PR ;所述的特异性逆转录引物REP从5'端到3'端方向依次包括接 头序列ADP和P1，所述ADP从5'端到3'端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC 序列，所述P1为与待测miRNA标记3'末端互补的6?8个碱基；所述NHS的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0007] 进一步的，所述上游引物PF从5'端到3'端方向依次包括非人类基因组序列TAS 和P2 ;所述TAS的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述P2为待测miRNA标记序列中除P1 的互补序列以外的碱基序列，且将U替换为T。
[0008] 具体的，所述下游引物PR从5'端到3'端方向依次包括非人类基因组序列TAF 和NHS ;所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No. 5。
[0009] 优选的，在上游引物PF或下游引物PR的5 '端标记荧光物质。
[0010] SEQ ID No. 1NHS :5, -GCTGTCAACGATACGCTACG-3，。
[0011] SEQ ID No. 2TTTTC 序列：5, -TTTTCTTTTCTTTT-3,。
[0012] SEQ ID No. 3ADP :5,-GCTGTCAACGATACGCTACG-TTTTCTTTTCTTTT-3，（ "-，，之前为 NHS，之后为TTTTC序列）。
[0013] SEQ ID No. 4TAS :5' -GTTCTT(CTTTTT)n-3' 字母 η 表示 CTTTTT 序列的重复次数，η 为大于〇小于7的整数。
[0014] SEQ ID No. 5TAF :5' -GTTCTTCTTTTTCTTTTTCT-3'。
[0015] SEQ ID No. 6PR ：
[0016] 5' -GTTCTTCTTTTTCTTTTTCT-GCTGTCAACGATACGCTACG-3'（ 之前为 TAF，"_"之 后为NHS)。
[0017] 本发明还提供了检测microRNAs的引物的制备方法，包括特异性逆转录引物REP 的制备、上游引物PF的制备和下游引物PR的制备；所述特异性逆转录引物REP的制备包括 如下步骤：1)引物序列的确定：确定待检测的miRNA标记的序列信息，采用可与待测miRNA 标记3'末端互补的6?8个碱基为逆转录引物中的特异性序列P1，在特异性序列P1的5' 末端加上一段接头序列ADP，所述ADP从5'端到3'端依次为非人类基因组的特殊序列NHS 和TTTTC序列，所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列 如SEQ ID No. 2所示；2)将确定序列的引物合成。
[0018] 进一步的，上游引物PF的制备包括如下步骤：1)引物序列的确定：采用待测 miRNA标记序列中除前述特异性序列P1的互补序列以外的碱基序列为待测miRNA标记上游 的特异性PCR引物P2,并将U替换为T，在待测miRNA标记上游的特异性PCR引物P2的5' 末端加上一段非人类基因组序列TAS，TAS的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；2)将确定序 列的引物合成。
[0019] 进一步的，下游引物PR的制备包括如下：1)引物序列的确定：从5'端到3'端方 向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS ;所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No. 5 ;2)将确 定序列的引物合成。
[0020] 优选的，在上游引物PF或下游引物PR的5 '端标记荧光物质。
[0021] 其中，在需要复合检测多个不同的microRNAs时，使用上述步骤分别制备相应各 个单个的microRNAs的引物，可在一个体系中进行复合检测。
[0022] 本发明还提供了检测microRNAs标记的方法，包括如下步骤：
[0023] a、引物合成：包括特异性逆转录引物REP的制备、上游引物PF的制备和下游引物 PR的制备；所述特异性逆转录引物REP的制备包括如下步骤：1)引物序列的确定：确定待 检测的miRNA标记的序列信息，采用可与待测miRNA标记3'末端互补的6?8个碱基为逆 转录引物中的特异性序列P1，在特异性序列P1的5'末端加上一段接头序列ADP，所述ADP 从5'端到3'端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述NHS的核苷酸序 列如SEQ ID No. 1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；2)将确定序 列的引物合成；
[0024] b、使用特异性逆转录引物REP对待测microRNAs进行逆转录扩增；
[0025] c、以逆转录的产物为模板，用上游引物PF和下游引物PR进行特异性扩增；
[0026] d、将步骤c得到的产物进行毛细管电泳检测。
[0027] 进一步的，步骤a中上游引物PF的制备包括如下步骤：1)引物序列的确定：采用 待测miRNA标记序列中除前述特异性序列P1的互补序列以外的碱基序列为待测miRNA标 记上游的特异性PCR引物P2,并将U替换为T，在待测miRNA标记上游的特异性PCR引物P2 的5'末端加上一段非人类基因组序列TAS，TAS的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；2)将 确定序列的引物合成。
[0028] 进一步的，步骤a中下游引物PR的制备包括如下：1)引物序列的确定：从5'端到 3'端方向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS ;所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No. 5 ; 2)将确定序列的引物合成。
[0029] 优选的，在上游引物PF或下游引物PR的5 '端标记荧光物质。
[0030] 其中，在需要复合检测多个microRNAs标记时，使用上述步骤分别制备相应各个 单个的microRNAs的引物，在一个体系中进行复合检测即可得到结果。优选的，复合检测多 个microRNAs标记的数量为不超过32个。
[0031] 本发明还提供了用于microRNAs检测的试剂盒，包括特异性逆转录引物REP、上游 引物PF和下游引物PR ;所述的特异性逆转录引物REP从5'端到3'端方向依次包括接头 序列ADP和P1，所述ADP从5'端到3'端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序 列，所述P1为与待测miRNA标记3'末端互补的6?8个碱基；所述NHS的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0032] 进一步的，所述上游引物PF从5'端到3'端方向依次包括非人类基因组序列TAS 和P2 ;所述TAS的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述P2为待测miRNA标记序列中除P1 的互补序列以外的碱基序列，且将U替换为T。
[0033] 具体的，所述下游引物PR从5'端到3'端方向依次包括非人类基因组序列TAF和 NHS ;所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No. 5。
[0034] 优选的，在上游引物PF或下游引物PR的5 '端标记荧光物质。
[0035] 本领域上述的试剂盒和检测方法在用于多microRNAs的复合检测时尤其具有特 别的优势。因此，显然上述试剂盒中可以包括多个针对microRNAs的上述引物。优选的，试 剂盒复合检测多个microRNAs标记的数量为不超过32个。
[0036] 本发明中，制备引物在序列确定后可采用本领域的通用方法制得。比如具体可采 用直接合成的方式得到。
[0037] 具体的，本发明还提供了检测miR214，miR451a，miR888和miR891a的试剂盒，包 括独立包装的特异性逆转录引物REP、上游引物PF和下游引物PR，所述的特异性逆转录引 物REP从5'端到3'端方向依次包括接头序列ADP和P1，所述ADP从5'端到3'端依次为 非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述P1为与待测miRNA标记3'末端互补的 6?8个碱基，所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列 如SEQ ID No. 2所示，具体见表1 :
[0038] 表1特异性逆转录引物
[0039]
【权利要求】
1. 用于microRNAs检测的引物，其特征在于：包括特异性逆转录引物REP、上游引物PF 和下游引物PR ;所述的特异性逆转录引物REP从5'端到3'端方向依次包括接头序列ADP 和P1，所述ADP从5'端到3'端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述P1 为与待测miRNA标记3'末端互补的6?8个碱基；所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. 如权利要求1所述的用于microRNAs检测的引物，其特征在于：所述上游引物PF从 5'端到3'端方向依次包括非人类基因组序列TAS和P2 ;所述TAS的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述P2为待测miRNA标记序列中除P1的互补序列以外的碱基序列，且将U替 换为T。
3. 如权利要求1或2所述的用于microRNAs检测的引物，其特征在于：所述下游引物 PR从5'端到3'端方向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS ;所述TAF的核苷酸序列如 SEQ ID No. 5。
4. 如权利要求1?3任一项所述的用于microRNAs检测的引物，其特征在于：在上游 引物PF或下游引物PR的5'端标记荧光物质。
5. 用于microRNAs检测的试剂盒，其特征在于：包括特异性逆转录引物REP、上游引物 PF和下游引物PR ;所述的特异性逆转录引物REP从5'端到3'端方向依次包括接头序列 ADP和P1，所述ADP从5'端到3'端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所 述P1为与待测miRNA标记3'末端互补的6?8个碱基；所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述上游引物PF从5'端到3'端方向依 次包括非人类基因组序列TAS和P2 ;所述TAS的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述P2 为待测miRNA标记序列中除P1的互补序列以外的碱基序列，且将U替换为T。
7. 如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述下游引物PR从5'端到3'端方 向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS ;所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No. 5。
8. 如权利要求5?7任一项所述的试剂盒，其特征在于：在上游引物PF或下游引物PR 的5'端标记荧光物质。
9. 检测microRNAs的引物的制备方法，其特征在于：包括特异性逆转录引物REP的制 备、上游引物PF的制备和下游引物PR的制备；所述特异性逆转录引物REP的制备包括如下 步骤：1)引物序列的确定：确定待检测的miRNA标记的序列信息，采用可与待测miRNA标记 3'末端互补的6?8个碱基为逆转录引物中的特异性序列P1，在特异性序列P1的5'末端 加上一段接头序列ADP，所述ADP从5'端到3'端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和 TTTTC序列，所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如 SEQ ID No. 2所示；2)制备得到确定序列的引物。
10. 如权利要求9所述的检测microRNAs的引物的制备方法，其特征在于：上游引物PF 的制备包括如下步骤：1)引物序列的确定：采用待测miRNA标记序列中除前述特异性序列 P1的互补序列以外的碱基序列为待测miRNA标记上游的特异性PCR引物P2,并将U替换为 T，在待测miRNA标记上游的特异性PCR引物P2的5'末端加上一段非人类基因组序列TAS， TAS的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；2)制备得到确定序列的引物。
11. 如权利要求9或10所述的检测microRNAs的引物的制备方法，其特征在于：1)引 物序列的确定：从5'端到3'端方向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS ;所述TAF的核 苷酸序列如SEQ ID No. 5 ;2)制备得到确定序列的引物。
12. 如权利要求9?11任一项所述的检测microRNAs的引物的制备方法，其特征在于： 在上游引物PF或下游引物PR的5'端标记荧光物质。
13. 检测microRNAs的方法，其特征在于：包括如下步骤： a、 引物合成：包括特异性逆转录引物REP的制备、上游引物PF的制备和下游引物PR的 制备；所述特异性逆转录引物REP的制备包括如下步骤：1)引物序列的确定：确定待检测 的miRNA标记的序列信息，采用可与待测miRNA标记3'末端互补的6?8个碱基为逆转录 引物中的特异性序列P1，在特异性序列P1的5'末端加上一段接头序列ADP，所述ADP从5' 端到3'端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述NHS的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；2)制备得到确定序 列的引物； b、 使用特异性逆转录引物REP对待测microRNAs进行逆转录扩增； c、 以逆转录的产物为模板，用上游引物PF和下游引物PR进行特异性扩增； d、 将步骤c得到的产物进行毛细管电泳检测。
14. 如权利要求13所述的检测microRNAs的方法，其特征在于：步骤a中上游引物PF 的制备包括如下步骤：1)引物序列的确定：采用待测miRNA标记序列中除前述特异性序列 P1的互补序列以外的碱基序列为待测miRNA标记上游的特异性PCR引物P2,并将U替换为 T，在待测miRNA标记上游的特异性PCR引物P2的5'末端加上一段非人类基因组序列TAS， TAS的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；2)制备得到确定序列的引物。
15. 如权利要求13或14所述的检测microRNAs的方法，其特征在于：步骤a中下游引 物PR的制备包括如下：1)引物序列的确定：从5'端到3'端方向依次包括非人类基因组序 列TAF和NHS ;所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No. 5 ;2)制备得到确定序列的引物。
16. 如权利要求13?15任一项所述的检测microRNAs的方法，其特征在于：在上游引 物PF或下游引物PR的5'端标记荧光物质。
【文档编号】C12Q1/68GK104120174SQ201410209010
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】侯一平, 颜静, 李岩, 魏蔚, 张 申请人:四川大学