一种ssr标记引物设计方法、小麦ssr标记引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了SSR标记引物设计方法。针对现有SSR标记引物多态性不足的缺陷，本发明提供了一种基于基因组草图序列设计新SSR标记引物的方法。本方法首先选择一位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物，其次将起始SSR标记引物与其所在染色体草图序列进行序列比对查找比对结果中的片段重叠群，然后搜寻片段重叠群中的SSR序列作为结果SSR序列，最后根据结果SSR序列设计SSR标记引物。本发明还提供了14对新的与小麦条锈病抗性有关的SSR标记引物，其中5对在供试遗传群体中产生多态性；以及以L693×L661和L661×L693F2单株作为作图群体的小麦遗传图谱构建方法。本发明方法可快速增加已知位点SSR标记引物的数量，增加SSR标记多态性，与基因初定位相结合可以快速加密遗传图谱。
【专利说明】一种SSR标记引物设计方法、小麦SSR标记引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分子标记引物设计方法及小麦分子标记引物，特别是涉及一种SSR分子标记引物设计方法及小麦SSR标记引物，属于基因工程、作物遗传育种领域。
【背景技术】
[0002]SSR标记以PCR技术为核心的DNA标记技术，其技术原理是利用SSR序列在基因组中分布广泛、多态性高，且SSR序列两端的序列多是相对保守的单拷贝序列的特征，根据检测基因组区域SSR序列两端的单拷贝序 列设计一对特异引物，再利用PCR技术，扩增每个位点的SSR序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。SSR标记具有多态性高、可靠性高等技术优势，是目前最为常用的SSR分子标记技术。但由于创建新的标记时需确定重复序列两端的序列信息，因此其引物开发存在困难且费用较高。
[0003]辅助育种是目前植物分子标记技术的重要应用【技术领域】之一。利用分子标记辅助育种，前提是用分子标记对育种所需要的基因进行精确的遗传学定位，定位越精细，利用分子标记作为诊断标记就越准确，就越能加快育种进程。目前利用SSR标记技术实现基因精细定位依然存在如下三方面技术缺陷:一、SSR标记引物开发成本高、开发周期长；二、尽管SSR标记多态性出现的几率相对较高，但是仍然还是有很多位点不会出现多态性。尤其是针对遗传背景相近的姐妹系衍生的遗传作图群体，已标记的位点间遗传距离依然较大，比如小麦染色体0.lcM，就需要更多的多态性分子标记；三、在利用近等基因系对小麦新基因进行作图时，由于近等基因系本身在遗传上非常相似，因而也会面临由于多态性分子标记太少，而不能将基因的位置定位到很精确的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种SSR标记引物设计方法，该方法基于基因组草图序列实现。利用新设计引物完成的SSR标记方法能够增加已知位点SSR标记多态性。
[0005]为实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0006]一种SSR标记引物设计方法，其特征在于:依照如下步骤实施:
[0007]步骤S1、选择一位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物；
[0008]步骤S2、将起始SSR标记引物与其所在染色体草图序列进行序列比对，比对精度不低于95%，查找比对结果中的片段重叠群；
[0009]步骤S3、搜寻步骤S2查找到的片段重叠群中的SSR序列作为结果SSR序列；
[0010]步骤S4、根据该结果SSR序列与其左右两侧序列设计扩增引物，得到结果SSR标记引物。
[0011]上述方法的基本技术原理在于:利用现有位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物，在该起始SSR标记引物所在染色体草图序列进行比对,查找包含该起始SSR标记引物序列的草图片段重叠群(Contig);再搜索该片段重叠群中SSR序列得到结果SSR序列，最后根据该结果SSR序列与其左右两侧序列设计出能扩增出该结果SSR序列的引物，即得到新设计出的SSR标记引物。依照此方法发现的结果SSR位点与起始SSR标记位点间物理距离很近(<10kb)，在减数分裂时，该物理距离内发生交换的概率很小(平均概率〈0.01%)， 因此两标记位点在遗传上可以视为完全连锁。如果比对查找到的草图片段重叠群中含有多个SSR位点，那么就可以实现从一个已知的SSR标记位点快速找到多个与其连锁的SSR标记位点。尽管SSR标记出现多态性的概率保持不变，但是由于SSR标记绝对数量增多可以使得标记呈现多态性的数量也随之增多，由此使得精细定位得以进行。利用引物设计方法设计出各新的结果SSR标记位点对应的引物，与PCR扩增相结合可以应用遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定、指纹图谱构建和分子标记辅助育种等领域。
[0012]上述方法，步骤S3中，一般选择5个核苷酸为重复元件的最大值。这是因为SSR 是指重复元件为2~5个核苷酸的重复序列，其重复元件越长，发生变异导致多态性的概率就越低。
[0013]上述方法，可做如下优化:优化一，步骤S4的引物设计中，在保证能将目的SSR序列扩增的前提下，引物设计长度19bp~25bp ;优化二，步骤S4的引物设计中，在保证能将目的SSR序列扩增的前提下，退火温度Tm值60°C，且上游和下游引物的Tm值相差不大于 2V ;优化三，步骤S4的引物设计中，以结果SSR序列与其左右两侧各150bp序列进行扩增引物设计；优化四，在上述优化基础上，进一步地，步骤S4的引物设计中，(G+C)含量控制在 40%~60%，PCR扩增产物长度150bp~250bp，尽量避免引物二级结构的出现。更进一步的是，(G+C)含量控制在55%。
[0014]上述SSR标记引物设计方法的一种优化方法是:步骤SI中首先进行目的基因的初定位，并在初定位确定的染色体区域内和/或附近寻找位点已知的SSR标记引物作为起始 SSR标记引物。优化后的方案可应用于遗传图谱的加密，获得高密度的分子标记遗传图谱。
[0015]本发明提供14对小麦SSR标记引物(表1、表2),该小麦SSR标记引物是以8对已知的小麦SSR标记引物作为起始SSR标记引物利用本发明公开的标记引物设计方法设计得到的结果SSR标记引物。
[0016]表1小麦SSR标记引物
[0017]
【权利要求】
1.一种SSR标记引物设计方法，其特征在于:依照如下步骤实施: 步骤S1、选择一位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物； 步骤S2、将起始SSR标记引物与其所在染色体草图序列进行序列比对，比对精度不低于95%，查找比对结果中的片段重叠群； 步骤S3、搜寻步骤S2查找到的片段重叠群中的SSR序列作为结果SSR序列； 步骤S4、根据该结果SSR序列与其左右两侧序列设计扩增引物，得到结果SSR标记引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤S4扩增引物设计中，退火温度Tm = 60°C，且上游与下游引物的Tm值相差不大于2°C。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤S4引物设计长度19bp~25bp。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤S4中，(G+C)含量控制在40%~60%, PCR扩增产物长度150bp~250bp。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤S3结果SSR序列搜寻中，选择5个核苷酸作为重复元件的最大值。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤SI中首先进行目的基因的初定位，然后在初定位确定的染色体区域内和/或附近寻找位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物。
7.利用权利要求1~6任一所述的SSR标记引物设计方法实现的SSR分子标记方法。
8.利用权利要求1~6任一所述的SSR标记引物设计方法设计得到的小麦SSR标记引物，其特征在于:所述起始SSR标记引物与所述结果SSR标记引物分别如表1所示: 表1小麦SSR标记引物
9.一种利用权利要求8所述的小麦SSR标记引物实现的小麦遗传图谱构建方法:其特征在于:依照如下步骤实施:步骤S1、以L693XL661与L661XL693的F2单株作为作图群体；步骤S2、提取作图群体植株的总DNA ；步骤S3、分别利用所述设计结果SSR标记引物以步骤S2所得总DNA为模版进行PCR扩增；步骤S4、利用生物学软件分析步骤S3所得PCR扩增结果，构建小麦遗传图谱。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述步骤S3中，PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.3XTBE,2000V电压电泳40min，经过银染后成像。
【文档编号】C12N15/10GK103571833SQ201310579379
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】罗培高, 李鑫, 陈万权, 张敏, 任正隆, 张怀渝 申请人:四川农业大学