一种检测非整倍体杂交子代植株的分子标记引物及非整倍体杂交子代植株的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测非整倍体杂交子代植株的染色体组成方法，属于生物技术中 植物遗传育种领域。
【背景技术】
[0002] 对染色体数目变异（多倍化和非整倍化）的利用是植物遗传改良的重要途径， 不同的染色体数目和染色体组成可以产生具有显著表型性状变异的个体材料。烟草 (Nicotiana)单体系列、曼陀罗（Daturastramonium)三体系列等高等植物染色体非整倍 性变异经典案例，均在株形或果实形态等方面表现出明显变异。因此，非整倍体育种是植物 遗传改良的重要领域。
[0003] 为分析多倍体和非整倍体的染色体组成，传统的染色体带型分析、荧光 原位杂交（FluorescentinsituHybridization,FISH)等核型分析方法被广泛 米用（DilkovaM,JellenEN,ForsbergRA.C-bandedkaryotypesandmeiotic abnormalitiesingermplasmderivedfrominterploidycrossesinAvena. Euphytica,2000, 111 (3) :175 - 184；XiongZ,GaetaRT,PiresJC.Homoeologous shufflingandchromosomecompensationmaintaingenomebalanceinresynthesized allopolyploidBrassicanapus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011, 108(19):7908 -7913；ZhangH,BianY,GouX，etal.Persistentwhole-chromosomeaneuploidyis generallyassociatedwithnascentallohexaploidwheat.Proc.Natl.Acad.Sci. USA，2013, 110(9) : 3447 - 3452)。然而，传统核型分析方法操作繁琐、技术难度大，对操作者 染色体制片及分析水平要求较高，且耗时长、成本高、效率低，不利于大规模群体的高通量 分析，尤其对于染色体数目多、形态相似、个体较小、特异探针缺乏的木本植物染色体而言， 更是难以通过传统核型分析方法区别不同染色体的差异。
[0004] 近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展，阵列比较基因组原位杂交 (arraycomparativegenomehybridization，aCGH)(HughesTR，RobertsCJ，DaiH，et al.WidespreadaneuploidyrevealedbyDNAmicroarrayexpressionprofiling.Nature Genet.，2000, 25(3) :333 - 337)、单核苷酸多态性基因型分析（SNPgenotyping)(Rauch A,RlischendorfF，HuangJ，etal.MolecularkaryotypingusinganSNParrayfor genomewidegenotyping.J.Med.Genet.，2004, 41 (12) : 916 - 922)等分子核型分析技术逐 渐成熟，并已在大麦、玉米等作物基因型分型研究中有所应用（CloseTJ，BhatPR，L〇naixli S，etal.Developmentandimplementationofhigh-throughputSNPgenotyping inbarley.BMCGenom.2009, 10:582；BeloA,BeattyMK,HondredD,etal.Allelic genomestructuralvariationsinmaizedetectedbyarraycomparativegenome hybridization.Theor.Appl.Genet.，2010, 120 (2) : 355 - 367)D 然而，高昂的检测成本限制 了上述新兴分子核型分析技术的广泛应用。因此，开发一种成本低廉、操作便捷、检测效率 高、可靠性强的核型分析技术对于林木个体染色体组成分析，推动非整倍体遗传改良具有 重要价值和实践意义，可望显著推动林木染色体工程育种研宄进展。
[0005] SSR(SimpleSequenceRepeat)是一种基于DNA长度多态性的分子标记技术，其 在动植物基因组中随机分布，呈共显性遗传，在遗传和物理图谱的构建、基因定位、遗传多 样性和物种进化分析、亲缘关系鉴定、DNA指纹图谱构建和分子标记辅助育种等方面广泛 应用，尤其可实现对复等位位点变化情况的共显性检测。目前，基于基因组序列和EST序 列已开发出大量杨树SSR标记引物（YinTM,ZhangXY,GunterLE，etal.Microsatellite primerresourceforPopulusdevelopedfromthemappedsequencescaffolds oftheNisqually-lgenome.NewPhytologist, 2009, 181 (2):498 - 503；DuFK,Xu F,QuH,etal.ExploitingthetranscriptomeofEuphratesPoplar,Populus euphratica(Salicaceae)todevelopandcharacterizenewEST-SSRmarkersand constructanEST-SSRdatabase.PloS0ne,2013,8(4):e61337)，并且均可定位于杨属 19 个不同的连锁群（染色体），为创新杨树非整倍体植株检测方法提供了可能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有关于非整倍体杂交子代植株的染色体检测技术存在的 技术缺陷，提供一种检测非整倍体杂交子代植株的分子标记引物及其应用和检测非整倍 体杂交子代的方法，本发明方法的检测成本低、易操作、检测速度快、检测结果准确、可靠性 强，且适用于大规模群体材料分析的杨树非整倍体植株染色体构成测定方法。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种检测非整倍体杂交子代植株的分子 标记引物，所述分子标记引物为SSR引物。
[0008] 其中，所述分子标记引物的碱基序列为SEQIDNO:1;SEQIDNO:2;SEQIDNO: 3;SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7 或SEQIDNO:8 所示。
[0009] 特别是，所述序列为SEQIDNO:1;SEQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4 的 分子标记引物与杨树I号染色体上标记位点碱基序列相对应；所述序列号为SEQIDNO:5 ; SEQIDNO:6的分子标记引物与杨树VIII号染色体上标记位点碱基序列相对应；所述序列 号为SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的分子标记引物与杨树X号染色体上标记位点碱基序列 相对应。
[0010] 本发明另一方面提供一种上述分子标记引物在检测非整倍体杂交子代植株中的 应用。
[0011] 其中，所述的非整倍体杂交子代植株来源于不同倍性体植株间的杂交。
[0012] 特别是，所述非整倍体杂交子代植株选择杨树非整倍体杂交子代植株。
[0013] 其中，所述杨树非整倍体杂交子代植株的父本是三倍体银中杨（Populus albaXP.berolinensis'Yinzhong'）、三倍体毛白杨（P.tomentosa)或三倍体青杨杂种； 母本是毛新杨（P.tomentosaXP.bolleana)、银腺杨（P.albaXP.glandulosa)或青杨派树 种。
[0014] 特别是，所述父本选择三倍体银中杨；母本选择二倍体毛新杨。
[0015] 本发明再一方面提供一种非整倍体杂交子代植株的检测方法，包括如下步骤：（1) 利用流式细胞术初步确定杂交子代植株的倍性水平和染色体数目；（2)提取的疑似非整倍 体杂交子代植株以及杂交双亲植株的幼嫩叶片的DNA; (3)以提取的DNA分别为模板，以分 子标记引物为PCR扩增引物，分别进行PCR扩增；(4)将PCR扩增产物分别进行毛细管荧光 电泳检测，对获得的等位基因峰的数目和高度进行辨认，确认杂交子代植株的等位基因的 组成情况，如果位于染色体上的标记位点数目超出或少于根据流式细胞术检测结果初步评 估的杂交子代植株的倍性水平和染色体数目，则可确定该植株为非整倍体植株，具有超数 或少数的该条染色体。
[0016] 其中，步骤（3)中所述的分子标记引物是SSR引物。
[0017] 特别是，所述的分子标记引物的碱基序列为SEQIDNO:1;SEQIDNO:2;SEQID NO:3;SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7 或SEQIDNO:8 所示。
[0018] 尤其是，所述序列为SEQIDNO:1;S