一种用于鱼腥草分子鉴定的标记、引物、试剂盒和鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及一种用于鱼腥草分子鉴定的标记、弓丨 物、试剂盒和鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 鱼腥草（HouttuyniacordataThunb)属三白草科蕺菜属，是宿根性多年生草本植 物。俗称有侧耳根、猪鼻孔、臭草、芩草等，因其茎叶搓碎后有鱼腥味，故名鱼腥草。鱼腥草 不仅可以嫩茎叶和地下茎作蔬菜食用，而且全株又可鲜用或晒干入药，它已经被国家卫生 部正式确定为"既是药品，又是食品"的极具开发潜力的资源之一，日益受到人们的关注。
[0003] 因国内外对鱼腥草的需求急剧增加，使其货源供应不足，各地曾一度出现混淆品， 少数不法分子掺伪作假、以伪乱真，兜售假药以牟取暴利，加之有些参与药材流通的人员缺 乏必要的鉴别知识或经验不足，使鱼腥草混伪品进入商品流通渠道，严重影响了药材质量 和临床疗效。
[0004] 以往大都以地上茎、地下茎和叶片等形态差异和解剖学特征，有时结合理化分析 来鉴别鱼腥草及其混伪品，但以上鉴定方法一是非长期从事该工作的人员不能胜任原植物 和药品的鉴定工作；二是费时费力，且准确鉴定存在一定难度。近年来，随着分子生物学技 术的发展，体现物种遗传本质的DNA分子已成为物种鉴定的有效分析手段。目前通过DNA 分子特征对鱼腥草植物进行分类学鉴定的研宄报道缺少真伪品的核苷酸差异比较信息，不 能提供可靠的分子鉴别数据。DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的DNA片段来对物 种进行准确鉴定的新技术，它具有操作简便、准确、快速的优势，不受样品发育阶段（叶片、 种子、花等）、药材形态（原药材或粉末）以及研宄者专业水平的限制，具有较强的通用性。
[0005] 但到目前为止，还没有应用DNA条形码技术对鱼腥草进行分子鉴别，更没有鱼腥 草的专用条形码的报道。本发明特别通过引物的选择开创性地利用DNA条形码技术对鱼腥 草进行分子鉴定。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有检测技术中存在的缺陷，从分子水平提供一种用于鱼腥 草分子鉴定的标记、引物、试剂盒和鉴定方法。本发明将加速分子标记辅助选择在鱼腥草及 其混伪品鉴定方法的应用。
[0007] 一种用于鱼腥草分子鉴定的标记，序列如SEQNO: 1 ;即可作为DNA条形码。
[0008] 一种用于鱼腥草分子鉴定的引物，序列如下：
[0009] 正向序列F:GTTATGCATGAACGTAATGCTC，
[0010] 反向序列R:CGCGCATGGAITCACAATCC。
[0011] 一种用于鱼腥草分子鉴定的试剂盒，包括上述的引物，以及进行PCR反应所需的 各种试剂。
[0012]PCR反应所需的各种试剂包括：10XBuffer、dNTP、MgCl2、TaqDNA聚合酶。
[0013] 所述的用于鱼腥草分子鉴定的试剂盒还包括测序试剂。
[0014] 一种用于鱼腥草分子鉴定的方法：以上述的核酸分子为引物，以待检测样品的基 因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增出的DNA片段经过测序，与序列如SEQNO: 1所示的鱼 腥草分子鉴定的标记比对，当相似性达到98%以上时，说明待鉴定的样品为鱼腥草。
[0015] 该方法用于区分鱼腥草与白苞裸蒴，将扩增出来的片段进行测序；序列如SEQ NO: 1和NO: 2 ;鱼腥草在位点46上的碱基为C，位点53上的碱基为T，位点88上和111上的 碱基都为C，位点136和146上的碱基都为T，位点173上的碱基为G，位点187-188上的碱 基都为TC，位点208上的碱基为G，位点277和279上的碱基都为A，位点297上的碱基为 C，位点299-300上的碱基为TT，位点301-304上的碱基为TTCT，位点313和328上的碱基 为T，位点334上的碱基为A，位点402上的碱基为T;而白荀裸蒴在位点46上的碱基为T， 位点53上的碱基为C，位点88上和111上的碱基都为T，位点136和146上的碱基都为缺 失，位点173上的碱基为T，位点187-188上的碱基为缺失，位点208上的碱基为T，位点277 和279上的碱基都为G，位点297上的碱基为缺失，位点299-300上的碱基都为缺失，位点 301-304上的碱基都为缺失，位点313上的碱基为缺失，位点328上的碱基为G，位点334上 的碱基为G，位点402上的碱基为G。
[0016] PCR体系包括 10XBuffer、0. 25mmol/LdNTP、2. 5mmol/LMgCL2、0. 2UTaqDNA聚合 酶、50ng模板DNA、引物 0? 2ymol/L。
[0017]PCR反应条件：97°C预变性4min- 30个循环：依次包括：94°C变性lmin、50°C退 火lmin和 72°C延伸lmin- 72°C延伸 7min。
[0018] 测序方法：
[0019] 采用5yL的反应体系，包括：1yL的测序mix，0. 5yL的引物（即PCR反应所用 引物），1yL的PCR纯化产物和2. 5yL的双蒸水；
[0020] 反应程序为：95°C预变性4min- 33个循环：依次包括96°C变性10s、50°C退火5s 和60°C延伸4min;
[0021] 测序反应产物经95 %乙醇+乙酸钠沉淀，之后用70 %乙醇、无水乙醇洗涤，干燥后 加入20yL的双蒸水充分溶解，经95°C变性4min后上样，进行测序。
[0022] 与传统技术相比，本发明所提供的鉴定方法：①克服了现有技术用感官难以鉴别 鱼腥草原料的真伪；②通过建立的鱼腥草DNA条形码，能轻易地将鱼腥草与其他植物区分 开来；③采用鱼腥草叶绿体DNA上一段内含子区域为目标片段，避免了染色体基因组的复 杂性所带来的PCR扩增成功的不确定性，使植物鉴定更加容易；④通过对不同产地来源的 鱼腥草叶绿体DNA片段的PCR测序分析，发现鱼腥草与其科下其它植物在序列位点上存在 稳定的差异，完全可以区分它们，因而本发明能准确地鉴定出鱼腥草植物；⑤本发明利用高 效自动化技术测序，即缩短了实验时间又降低了繁杂的人工测序劳作，易于对扩增样本进 行标准化分析，提高了数据的可靠性。
【附图说明】
[0023] 图1为引物对样品材料的扩增结果；
[0024] 图2为鱼腥草植物（右）与其混伪品白苞裸蒴（左）的形态比较。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0026] 实施例1:本发明方法实施的过程
[0027] (1)样品材料的准备：分别取鱼腥草和其同科的其他植物幼嫩叶片10g左右。
[0028] (2)基因组DNA的提取：利用CTAB法提取基因组DNA，将冷冻干燥的烟草叶片研 磨成粉末，加入65°C预热的CTAB抽提液，65°C保温45min以上，间或轻摇混匀一12000r/ min室温离心20min后取上清液一加入