半滑舌鳎微卫星标记三重pcr家系识别引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于增殖放流群体跟踪溯源的分子标记辅助技术，是一种半滑舌鳎微卫星 标记三重PCR家系识别引物及识别方法。
【背景技术】
[0002] 半滑舌觸（Cynoglossus semilaevis)为东北亚特有的名贵冷温性海水鱼类，在我 国沿海均有分布。上世纪70年代以来，由于环境污染、生境破坏、过度捕捞和全球气候变化 等因素的影响，半滑舌鳎资源严重衰退。为促进地方性珍稀品种半滑舌鳎的种群资源恢复， 自2007年以来，在渤、黄海沿岸陆续开展了规模性的半滑舌鳎增殖放流活动。2009年，半滑 舌鳎被农业部列为10个渔业主导品种之一。经过持续几年的大规模种苗放流，半滑舌鳎资 源量得到一定程度的补充。但因缺乏有效的标志手段对放流群体进行标记跟踪，无法从回 捕数据、资料来掌握放流半滑舌鳎的分布、生态、资源量及放流效果。
[0003] 分子标签作为一种新型的标志技术在评估资源增殖效果方面应用前景广阔。每 对父母繁育的后代都有一致的DNA分子指纹标签，该分子标签为个体/家系特有且维系一 生。利用家系内个体所特有的分子标签，结合亲鱼大规模家系育苗，采用分子指纹图谱检测 技术，将遗传背景一致的家系种苗按照一定的比例作为"内标"掺入到相同规格的增殖群体 中，回捕后，通过对样品进行特定分子标签检测，结合软件分析，从回捕样品中识别"内标" 个体，据其数量即可推算出回捕群体中增殖放流个体所占比例，从而实现评估回捕率，推算 野生群体资源量、量化增殖亲本贡献率、预测幼鱼发生量等目的。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题在于提供一种半滑舌鳎微卫星标记三重PCR家系识别 引物及方法，针对半滑舌鳎增殖放流中难以精确计算回捕率的难题，本发明能够对半滑舌 鳎特定增殖放流群体进行跟踪溯源，评估放流半滑舌鳎的分布、生态、资源量及放流效果。
[0005] 本发明是通过如下技术方法实现的：
[0006] -种半滑舌鳎微卫星标记三重PCR家系识别引物，所述的引物如表1所示。
[0007] 表1.半滑舌鳎家系识别微卫星引物信息
[0009] 利用上述引物进行家系识别的方法，利用两种荧光（6-FAM和HEX)对三对微卫星 引物进行标记，根据其PCR扩增产物的荧光色彩和片段大小进行区分；利用引物设计软件 排除这三对引物在PCR反应过程中形成二聚体的可能；组合这三对引物于同一个PCR反应 体系中；优化PCR反应体系，建立这三对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数和 PCR反应程序；PCR产物经ABI3130或类似基因分析仪进行分子标签分析，相同荧光标记的 产物通过片段大小进行判断，对半滑舌鳎不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的 识别和鉴定。
[0010] 进一步，所述的 PCR 反应体系 IOxBuffer 2·5μ1，0·9πιΜ Mg2+，0.2mM dNTP，三对引 物正向及反向序列各0. 10 μ M，1.0 unit DNA聚合酶，IOOng基因组DNA，补充灭菌双蒸水使 PCR反应体系达到25 μ 1。
[0011] 进一步，所述的PCR反应程序为：94°C变性5min ;94°C变性45s，58°C退火45s， 72°C延伸45s，共10个循环；94°C变性45s，58°C退火45s，72°C延伸45s，退火温度每个循环 降低0. 4°C，共10个循环；94°C变性45s，54°C退火45s，72°C延伸45s，退火温度每个循环降 低0· 5°C，共5个循环；72°C延伸lOmin。
[0012] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0013] 本方法将需要分别进行三次微卫星PCR扩增和三次产物检测的半滑舌鳎家系判 另IJ，整合为一次三重PCR反应体系和一次产物检测，可大大提高半滑舌鳎微卫星标记的检 测效率，组合的三重PCR技术对半滑舌鳎单亲排除率为99. 66 %，个体识别率为99. 99 %。使 用荧光标记，可提高产物的分辨力，避免常规检测中由于不同位点产物片段大小接近时无 法有效区分的弊病。利用该三重PCR反应体系进行半滑舌鳎家系识别，可以大大节约包括 PCR与电泳检测试剂、耗材及时间成本。
【附图说明】
[0014] 图1:三重PCR在ABI3130遗传分析仪上的扫描结果：Cse61引物的扩增片段 为184bp和189bp ;Cyse47引物的扩增片段为196bp和204bp ;Hsts-h引物的扩增片段为 279bp 和 290bp。
【具体实施方式】
[0015] 半滑舌鳎微卫星标记的开发是利用磁珠富集法分离获得，对含有微卫星位点的序 列设计引物从而实现对半滑舌鳎特定微卫星位点的PCR扩增。首先利用引物设计软件分析 排除三重PCR引物彼此形成引物二聚体、发荚结构的可能，再通过实验检测验证三重PCR的 扩增效果，对于检测到的严重影响三重PCR反应的二聚体及发荚结构的引物进行修改，使 其完全适合三重PCR反应体系。对扩增产物大小差异显著（>50bp)的两对引物进行相同的 单引物焚光标记，具体为Cyse47和Hsts-h两对引物进行6-FAM焚光标记，Cse61引物进行 HEX荧光标记。组合这三对引物于同一个PCR反应体系。优化PCR反应体系，建立三对引物 可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数，这些参数是：IOxBuffer 2.5 μ l，0.9mM Mg2+， 0. 2mM dNTP，三对引物正向及反向序列各0.10 μ M，1.0 unit DNA聚合酶，IOOng基因组DNA， 补充灭菌双蒸水使PCR反应体系达到25μ1。PCR反应程序为：94°C变性5min ;94°C变性 45s，58°C退火 45s，72°C延伸 45s，共 10 个循环；94°C变性 45s，58°C退火 45s，72°C延伸 45s， 退火温度每个循环降低0. 4°c，共10个循环；94°C变性45s，54°C退火45s，72°C延伸45s，退 火温度每个循环降低〇. 5°C，共5个循环；72°C延伸IOmin。PCR反应过程在常规PCR仪上 进行。PCR产物经ABI 3130或类似基因分析仪根据荧光标记进行微卫星位点分析。相同荧 光标记的产物通过片段大小进行判断。三对微卫星引物的序列如下：
[0016] Cyse47 正向序列为（5' -3'）：CGGACGGAGAGTAAAAACAGA，反向序列为（5' -3'）： TGGTATGAACACTGAACCTGAGA ；
[0017] Cse61 正向序列为（5' -3'）：GTCCAACAACAACAGCAGCA，反向序列为（5' -3'）： CTGGAAGTTGAAGCCCTGTC ；
[0018] Hsts-h 正向序列为（5' -3'）：ACTTGGCTTCAAATACACTCTT，反向序列为（5' -3'）： GTACCGATCATATCCTGCTCTT。
[0019] 技术指标：
[0020] Cyse47、Cse61 和 Hsts-h 位点的目的片段分别为 194/204bp、184/189bp 和 279/290bp，具有的等位基因数分别为26, 30和22个，由此组合的三重PCR技术对半滑舌鳎 单亲排除率为99. 66 %，个体识别率为99. 99 %。
[0021] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0022] 本发明对半滑舌鳎亲本精心选择，一对一建立全同胞家系，标记并保存好家系亲 本，为子代个体的识别认证奠定了基础。
[0023] 本发明用于家系识