日本黄姑鱼微卫星dna标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分子标记技术，特别涉及一种日本黄姑鱼微卫星DNA标记。
【背景技术】
[0002] 微卫星DNA又称为短串连重复序列（STR)、简单重复序列（SSR)、简单序列长度多 态性（SSLP)，是指基因组中以1-6个核苷酸为单位串联重复组成的核苷酸序列；其中，最常 见的是双核苷酸重复，如（(AC/TG)η及（AG/TC)η。不同的生物个体由于重复基序的重复次 数不同而显示出多态性。研宄表明，可能是DNA复制过程中的"链滑"(strand slippage)现 象造成微卫星DNA多态性信息容量（polymorphic information content，PIC)较高。微卫 星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为群体遗传多 样性的分析、亲缘关系的鉴定、基因组作图和遗传育种的优越的分子标记，与等位酶、RAPD 方法相比也有一定的优越性。由于微卫星具有数量多、在基因组内分布均匀、多态性信息丰 富、易于检测等优点被作为优良的遗传标记（genetic marker)而得到广泛应用。根据重复 单元的构成与分布，微卫星DNA序列被分为三种类型：单一型（pure)，复合型（compound)， 间断型（interrupted)，例如：
[0003] 单一型：CACACACACACACACACACA
[0004] 复合型：CACACACACACAGAGAGAGA
[0005] 间断型：CACATTCACACATTCATTCA
[0006] 日本黄姑鱼，俗称黑毛鳇，英文名Giant croaker，拉丁名Nibea japonic，属鱼卢形 目，石首鱼科，黄姑鱼属，为大型优质食用鱼类，主要分布于中国东海、南海及日本南部沿 海。近年来，由于捕捞过度、环境污染、生境破坏等原因而衰退，加上渔场缩小等原因，使得 当前其自然分布数量十分有限，为恢复和增加日本黄姑鱼野生渔业资源，日本、韩国等分别 从上世纪80年代和90年代起就开展日本黄姑鱼的增殖放流工作，我国则相对较晚，从2005 年突破日本黄姑鱼全人育苗开始，连续开展了规模化增殖放流工作，年均放流量近百万尾， 并取得了一定成效。
[0007] 随着分子生物学技术和分子遗传学的迅速发展，分子标记作为个体识别工具的优 势逐渐凸显出来（PaIsb 0Ih 1999)，现已成为评估渔业资源增殖放流效果重要而有效的手 段之一。日本的Sekino等（2001)利用线粒体DNA和微卫星标记技术对养殖褐牙鲆进行标 记，成功地追踪到了放流的褐牙鲆个体。然而，在日本黄姑鱼遗传结构和种质鉴定方面，仅 见柴学军等（2007, 2009, 2013)曾分别利用RAH)标记、线粒体Cyt b基因、16S rRNA和COI 基因对日本黄姑鱼和輓状黄姑鱼进行种质鉴定，初步评价了日本黄姑鱼的遗传多样性。但 是上述遗传标记不能提供足够的遗传信息。为了进一步了解日本黄姑鱼亲体、回捕群体的 种群结构和遗传多样性等方面的信息，需要开发新的分子遗传标记。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种日本黄姑鱼微卫星DNA标记，建立了日本黄姑鱼微卫星DNA的技 术体系并利用这些分子标记进行日本黄姑鱼亲体、回捕个体的分类及遗传多样性的分析。
[0009] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0010] 一种日本黄姑鱼微卫星DNA标记，所述的微卫星编号为：NJB01，NJB04, NJB06， NJB15, NJB35;其核苷酸序列依次如SEQ ID ΝΟ:1-5所示。本发明包括日本微卫星（CT)n、 (AG)n、（TG)η和（AC)η富集文库的构建，含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到496 个含有微卫星重复序列的克隆，确定了 6个多态性丰富的微卫星标记NJBOl，NJB04, NJB06， NJB15, NJB35 ;NJB01为836个核苷酸、NJB04为440个核苷酸、NJB06为927个核苷酸、NJB15 为310个核苷酸、NJB35为681个核苷酸。
[0011] 作为优选，所述的NJB01、NJB04、NJB06、NJB15、NJB35六个位点的引物序列为，其 核苷酸序列依次如SEQ ID NO :6-17所示：
[0012] NJBOlF ：TTACATTCAGCAGGTATAGACAC
[0013] NJBOlR ：TTAACAGGTAGCCAATGCAAAGA
[0014] NJB04F ：AAATTTGCTCCTGACCGACCAC
[0015] NJB04R ： CGAGACCAAACCGTAAGAGTTGTA
[0016] NJB06F ： CCCCTCCAACAAATCAACCCTT
[0017] NJB06R ： TCTCGCCTATACTGACAATGTAAC
[0018] NJB15F ：GTTACCCAGTGTGCAGTCTTG
[0019] NJB15R ：AAGTCTGCTCCAGTTATTCGGTT
[0020] NJB35F1 ：AACCCTCTATCTCCTTCTGTGC
[0021] NJB35R1 ：TATTCACAAGATGATGCCTACTG
[0022] NJB35F2 ：AACCCTCTATCTCCTTCTGTGC
[0023] NJB35R2 ： CCTGGCCCATCTTCTATCTCAGC 〇
[0024] 本发明的有益效果是：本发明提供了 6个日本黄姑鱼新的微卫星位点及扩增这6 个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于日本黄姑鱼不同群体的遗传多样性研宄以 及亲权鉴定的研宄，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
【附图说明】
[0025] 图I :NJB01位点的引物扩增60尾日本黄姑鱼基因组DNA的STR分型图；
[0026] 图2 :NJB04位点的引物扩增60尾日本黄姑鱼基因组DNA的STR分型图；
[0027] 图3 :NJB06位点的引物扩增60尾日本黄姑鱼基因组DNA的STR分型图；
[0028] 图4 :NJB15位点的引物扩增60尾日本黄姑鱼基因组DNA的STR分型图；
[0029] 图5 :NJB35a位点的引物扩增60尾日本黄姑鱼基因组DNA的STR分型图；
[0030] 图6 :NJB35b位点的引物扩增60尾日本黄姑鱼基因组DNA的STR分型图；
[0031] 在图1-图6中，1-20代表20尾日本黄姑鱼亲鱼，21-40代表子一代；41-60代表 回捕个体。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本发明保护范围。
[0033] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常 规方法。
[0034] 实施例：
[0035] 1、日本微卫星DNA质粒文库的构建：
[0036] I. 1 基因组的提取：参照 Al janabi 和 Martinez 等（1997，Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques[J]. Nucleic Acids Research, 25 (22) :4692 - 4693)的方法提取日本黄姑鱼基因组DNA，DNA样品在 0.8 %琼脂糖凝胶上电泳检测。
[0037] L 25' -锚定