双峰驼多态性引物及其筛选方法和鉴定亲子关系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物及其筛选方法和用 于鉴定亲子关系的方法，属于动物分子生物学技术领域。具体讲，本发明设及一种从双峰驼 转录组数据中挑选出18个SSR(简单重复序列，Simple Sequence R巧eat,简称SSR)分子 标记，并分别合成其多态性引物，并将所述多态性引物用于双峰驼亲子关系的鉴定中。
【背景技术】
[0002] 准确、快速进行哺乳动物亲子关系鉴定，对于哺乳动物亲子关系审定、亲缘关系保 护、真假亲子辨别、亲子关系的产权纠纷等方面均有重要作用。目前已经利用已有的SSR 分子标记对牛、马、羊等哺乳动物进行了亲子鉴定实验化D Schn油el等，2000, Animal Genetics, 31 (6) ;360-366;Teruaki TOZAKI 等，2001，J Vet Med Sci，63(ll) ;1191-1197; G Lu 化 art 等，1999，Animal Genetics, 30(6) ;431-438)。简单重复序列 SSR 又叫作微卫星 (Microsatellites)序列，是由1-6个核巧酸为重复单位组成的长达几十个核巧酸的重复 序列。与其他分子标记相比，SSR标记具有多态信息含量丰富、W孟德尔方式遗传、呈共显 性、技术简单、重复性好、特异性强等特点。
[0003] 在上世纪九十年代中后期，研究者们已从美洲驼中筛选出了 54个微卫星分子标 记（Lang 等.1996 ;15 个位点；Obreque 等.1998, 1999 ;23 个位点；Penedo 等.1999a，b ; 14个位点；McPartlan等.1998 ;2个位点）。2007年J. Agopito等研究人员从W上的54 个微卫星位点中挑选了 10 个位点（LCA19、LCA37、YWLL40、YWLL29、YWLL36、LCA5、LCA66、 YWLL08、LCA08、YWLL44)用于羊驼的亲子鉴定中；2010年P. B. S. Spencer等研究人员挑选 了 17 (V0LP03、V0LP10、V0LP32、V0LP67、LCA37、LCA56、LCA65、LCA66、LCA70、LCA77、CMS16、 CMS50、YWLL08、YWLL38、YWLL44、CV化01、CV化07)个位点用于单峰驼的亲子鉴定中。2003 年，D. evdotchenko等从一峰雄性双峰驼的基因组中筛选出了 32个微卫星分子标记，其中 14个位点有详细说明。本发明从一峰雄性野生双峰驼的公开的转录数据中筛选SSR分子标 记，并检验该些位点在亲子鉴定中的应用，在双峰驼亲缘关系的审定和辨别、亲缘关系的保 护、产权纠纷等领域具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004] 针对目前对双峰驼亲子关系鉴定方法只能用传统的方法记录，工作量大且易丢失 等一系列问题，本发明提供了一种双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物及其筛选方 法，和所述多态性引物用于鉴定亲子关系的方法。
[0005] 一方面，本发明提供了一种双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物， 包括；XM_006194104_5177-5222 正、反向引 物，XM_006191380_10：M-1055 正、反向 引物，XM_006186221_4890-4933 正、反向引物，XM_006185105_1253-1274 正、反向 引 物，XM_006184182_1654-1697 正、反向引 物，XM_006183662_2012-2041 正、反向 引物，XM_006182535_1080-1115 正、反向引物，XM_006182052_4595-4622 正、反向 引物，XM_006180554_882-917 正、反向引物，XM_006177721_2115-2144 正、反向引 物，XM_006177716_989-1008 正、反向引物，XM_006173968_3405-3428 正、反向引物， XM_006173207_3661-3682 正、反向引物，XM_006172972_1548-1587 正、反向引物。
[0006] 上述14对多态性引物的具体信息如下；
[0007] 表 1 [000引
【主权项】
1. 一种双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物，包括： XM_006194104_5177-5222 正、反向引物，XM_006191380_1034-1055 正、反向 引物，XM_006186221_4890-4933 正、反向引物，XM_006185105_1253-1274 正、反向 弓丨物，XM_006184182_1654-1697 正、反向弓丨物，XM_006183662_2012-2041 正、反向 引物，XM_006182535_1080-1115 正、反向引物，XM_006182052_4595-4622 正、反向 引物，XM_006180554_882-917 正、反向引物，XM_006177721_2115-2144 正、反向引 物，XM_006177716_989-1008 正、反向引物，XM_006173968_3405-3428 正、反向引物， XM_006173207_3661-3682 正、反向引物，XM_006172972_1548-1587 正、反向引物。
2. 如权利要求1所述的多态性引物，其特征在于所述引物的具体信息如下（5'到3'）： XM_006194104_5177-5222 正向引物序列 F:GAAACAAGCCTTACTCAT，反向引物序列 R:AAGGTGCTATACTTCTGTGA,207-219bp ； XM_006191380_1034-1055 正向引物序列 F:GTCATCACGACGGACTGC，反向引物序列 R:CAAGGAGACGCAAGCATT，334-357bp ; XM_006186221_4890-4933 正向引物序列 F:TTCTGGGCAATGATGGGATG，反向引物序列 R:AGGAAGGAGGTTCTTTGTCT，203-243bp ; XM_006185105_1253-1274 正向引物序列 F:TGACCACCAAGGAGAAGC，反向引物序列 R:CCACGATGGCATAAGGAA，314-320bp ; XM_006184182_1654-1697 正向引物序列 F:CAATCCCGCCTGATTCCT，反向引物序列 R:CATTGAGAAGAATAGAGGTGGA，170-196bp ; XM_006183662_2012-2041 正向引物序列 F:AACGTCTGCGTGTATGGC，反向引物序列 R:CCCTAAAGTAAAGCAAACCC，237-249bp ; XM_006182535_1080-1115 正向引物序列 F:CAGATAATCAGACCAGCGTTAC，反向引物序列 R:AAGCCTTCAATAGTCTTCATC，256-296bp ; XM_006182052_4595-4622 正向引物序列 F:AGTTCAAATCAGTCGTCCTT，反向引物序列 R:TGGTAACTCCCTTTGGTA，307-315bp ; XM_006180554_882-917 正向引物序列 F:AAGCAGGTGTTTGATTTGT，反向引物序列 R:CCAGGGAGAATGGAGAATA，128-153bp ; XM_006177721_2115-2144 正向引物序列 F:TCTGTGCCACGCCCTTAC，反向引物序列 R:AAGGACACCAGGGAAACTAG，181-192bp ; XM_006177716_989-1008 正向引物序列 F:ACTGGCACAACTGGAAGC，反向引物序列 R:ATTGGTGGAAACAGAACA，251-256bp ; XM_006173968_3405-3428 正向引物序列 F:CCTGGACGGCAGTGATAG，反向引物序列 R:TAATCCCTTACTCCCTGAAAA，389-410bp ; XM_006173207_3661-3682 正向引物序列 F:ATAGAAGCATGTCGGTAG，反向引物序列 R:CCCTCTGCTGGCACTGAA，321-378bp ; XM_006172972_1548-1587 正向引物序列 F:CGCTGGGACAGCTAAGAC，反向引物序列 R:CTTTCTGGTAAAGGCAAC，170-233bp。
3. 权利要求1所述的多态性引物的筛选方法，包括： 通过双峰驼的转录组序列筛选SSR位点，得到双峰驼微卫星分子序列，设计引物，通过 琼脂糖凝胶电泳筛获得粗选的双峰驼微卫星分子标记的多态性引物并进行荧光标记； 采用核酸提取试剂盒法（磁珠法）提取不同群体双峰驼基因组DNA ; 将所述粗选的的多态性引物和所述基因组DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物； 再将所述变性的混合液采用3730x1设备进行毛细管电泳，用GeneMapper 4. O软件进 行分子量标准校对和微卫星基因型分型，筛除等位基因数小于等于4或出现极端分布的引 物，得到权利要求1所述的双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR引物为正向引物5'端带有荧光标记 的荧光引物，其荧光标记选自HEX-绿色、FAM-蓝色或TAM-黄色；
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增体系包括：模板基因组DNA lμL，10XTaqBuffer，10mMdNTPs，25mMMgCl2,5UTaqDNA聚合酶，10μM所述双峰驼转 录组微卫星分子标记的多态性引物，所述PCR扩增体系的总体积为25 μ L ; 所述PCR扩增程序为： 95°C预变性3min ;95°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸30s，10个循环，每个循环降 温0.5°0，最后72°0延伸61^11;95°0预变性31^11，95°0变性3〇8,58°0退火3〇8,72°0延伸 30s，20个循环，最后72°C延伸6min。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述电泳条件为：lwt%琼脂糖凝胶、150V、 IOOmA 电泳 20min。
7. -种利用权利要求1所述的多态性引物鉴定双峰驼亲子关系的方法，包括： 利用EDTA抗凝管采集具有亲子关系的双峰驼全血样品，然后采用核酸提取试剂盒法 (磁珠法）提取双峰驼基因组DNA ; 将所述双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物和所述基因组DNA混合并进行PCR 扩增，得到扩增产物； 吸取所述扩增产物〇. 5-1. 0 μ L与990 μ L HIDI和10 μ L LIZ500的混合物10 μ L进行 混合，并将混合液在98°C、变性5min后置于冰水混合物上急速冷却，得到变性的混合液； 再将所述变性的混合液采用3730x1设备进行毛细管电泳，用GeneMapper 4. 0软件进 行分子量标准校对和微卫星基因型分型，最后对所述结果进行双峰驼亲子关系的分析。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于所述亲子关系的分析方法为：利用cervus 4. 0软件中的Parentage Analysis程序计算每个蛇盖与其亲生母亲或父亲之间的LOD值。
9. 如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述亲子关系的判断标准为：当LOD值 大于3时，假定的母驼或公驼是驼羔亲生父亲或母亲的概率为大于95%，当LOD小于-2时， 假定的公驼或母驼与驼羔没有亲缘关系。
10. 权利要求1或2所述的双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物在双峰驼遗传 多样性分析中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物设计及其筛选方法和用于鉴定双峰驼亲子关系的方法。所述的多态性引物鉴定双峰驼亲子关系的方法包括：利用EDTA抗凝管采集具有亲子关系的双峰驼全血样品，然后采用核酸提取试剂盒法(磁珠法)提取双峰驼基因组DNA；将所述双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物和所述基因组DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述PCR产物进行3730XL型仪器毛细管电泳检测SSR分子标记；对所述结果进行亲子关系分析。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104630383
【申请号】CN201510114950
【发明人】吉日木图, 明亮
【申请人】内蒙古农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年3月17日