用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，具体地说，涉及用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定 的微卫星标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 系谱信息在牛育种中起着重要的作用。错误的系谱会大大降低遗传评定准确性， 影响选种选配的效果，降低群体的遗传进展，给养牛业带来巨大经济影响。然而，在实际养 殖生产中，系谱记录错误是难免的，它受多种因素影响，如配种记录、产犊记录、系谱录入及 整理中的人为错误等，尤其在饲养粗放的散养式牧场，犊牛出生后很难确定父亲甚至双亲， 往往会造成系谱错误。
[0003] 目前，在我国牛亲缘关系鉴定研究和应用最多的是微卫星标记法。田菲（2006 年）从30个微卫星标记中选择9个标记和3个候选标记作为中国荷斯坦牛亲子鉴定的 微卫星标记组合。贺建宁、宋玲（2010年）利用12个微卫星标记对西门塔尔牛亲子鉴定 进行初步探讨。周磊（2011年）对利用微卫星和SNP标记信息进行奶牛亲子鉴定的模拟 进行了研究。郭立平（2013年）利用微卫星和SNP标记对西门塔尔牛进行亲子推断的研 究。另外，CN101024857A公开了中国荷斯坦奶牛的亲子鉴定方法及其专用引物与试剂盒； CN101705299A公开了牛微卫星标记组合及其应用。由于不同物种微卫星标记的分布比例存 在差异；且高度近亲的不同品种间，微卫星标记也存在一定保守性和差异性，同时微卫星标 记具有高度的个体特异性，两个无关个体具有相同微卫星的概率低于10 4。
【发明内容】
[0004] 本发明针对中国西门塔尔牛牛群特点，旨在提供用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴 定的微卫星标记组合。另外，针对已有基因分型技术上存在着操作复杂、耗时、重复性低等 缺点，以及现有商业化试剂盒价格昂贵，检测成本高等不足之处，通过检测技术的改进，实 现在筛选基因型的同时达到检测的目的。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标 记，由下述 10 个标记组成：TGLA53、BM2113、INRA023、TGLA122、CSSM66、ETH225、SPS115、 HAUT27、INRA037 和 ETH10。
[0006] 上述10个标记位于染色体的位置、引物等基本特征如下：
[0007]
[0008] 本发明还提供用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的PCR检测试剂盒，所述试剂盒 含有用于扩增所述微卫星标记的PCR引物。
[0009] 本发明还提供所述微卫星标记在中国西门塔尔牛亲子关系鉴定中的应用。
[0010] 前述的应用是以待测牛的基因组DNA为模板，利用多重荧光PCR和毛细管电泳技 术结合进行基因型检测。
[0011] 具体步骤包括：（1) DNA提取：牛血液或精液DNA提取；（2)荧光标记PCR扩增：扩 增所述10个微卫星标记特异性目的片段；（3)基因分型：荧光标记毛细管电泳技术分析所 述标记的基因型。
[0012] 具体操作过程如下：
[0013] 1、按照常规方法进行牛血液DNA提取或公牛冻精DNA的提取。
[0014] 2、根据扩增产物大小选择引物所标记的荧光素，特别对于片段长度有重叠的标 记，用不同的荧光染料修饰，这样可使不同颜色的微卫星标记同时检测，提高检测效率。（表 1)
[0015] 表1根据扩增产物大小选择不同荧光素标记
[0016]
[0017] 通过优化扩增条件和调整引物浓度，筛选最佳PCR体系组成、扩增条件，建立了 10 个标记的最优扩增体系。
[0018] 以20 y L总体积为例，PCR扩增的反应体系见表2。
[0019] 表2PCR反应体系
[0020]
[0021] PCR反应条件见表3。
[0022] 表3 PCR反应条件
[0023]
[0024] 3、基因分型
[0025] 由于步骤2中PCR产物根据片段长度和不同荧光颜色进行了标记，因而通过3次 毛细管电泳即可获得不同微卫星标记座位的基因型。
[0026] 将步骤2中每组PCR产物样品板装入ABI PRISM3730XL遗传分析仪进行电泳。利 用GeneMaPPerTM4. 0软件，设定分子量标准条带后，根据遗传分析仪所收集电泳荧光信号 的颜色和位置，自动计算各标记座位的基因型。
[0027] 进一步地，本发明是根据待测牛个体的基因型以及累积排除概率（Combined exclusion probabilities)确定待测中国西门塔尔牛亲子关系，即根据待测牛个体和候选 亲本的基因型是否一致以及计算待测个体与候选亲本的累积排除概率来确定待测个体和 候选亲本是否有亲缘关系。其原理及计算过程如下：
[0028] 亲子鉴定是基于孟德尔遗传的两个基本定律：分离和自由组合规律。子代的两个 同对等位基因一个来自父亲，一个来自母亲。通过结果分析，如果符合孟德尔遗传定律，则 不能排除具有亲子关系，否则可排除其亲子关系。根据孟德尔遗传定律，后代染色体上的全 部基因，一半遗传于其亲生父亲，一半遗传于其亲生母亲。因此在应用微卫星基因座进行亲 子鉴定时，（i)肯定子代的某个标记基因型来自亲生父亲，而候选父亲并不携带此标记基因 型，这就违背了孟德尔遗传定律，可以排除子代与候选父亲之间的亲缘关系；（ii)肯定子 代的某个标记基因型来自亲生父亲，而候选父亲也携带此标记基因型，其符合孟德尔遗传 定律，据此不能排除子代与候选父亲之间的亲缘关系，但是可以利用似然函数计算它们之 间亲缘关系的相似程度。
[0029] 根据孟德尔遗传定律，（1)如果累积排除概率> 0. 99,子代所检测的标记基因型 与候选父亲完全一致，可确定其为子代的生物学父亲；（2)如果累积排除概率> 0. 99,子代 所检测的标记基因型与候选父亲存在2个或以上基因型不遵循遗传规律，可排除其为子代 的生物学父亲。
[0030] 首先，计算所检测标记的非父排除概率及累积排除概率。非父排除概率 (probability of paternity exclusion，PE)是评价遗传标记在亲子鉴定中实用价值大小 的一个重要指标；是利用各位点的等位基因频率来计算候选父亲某标记的等位基因不是来 自亲生父亲的排除概率。非父排除概率的计算一般分以下三种情况计算：
[0031] (1)当另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率为：
[0032]
[0033] (2)当另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率为：
[0034]
[0035] (3)排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的排除概率为：
[0036]
[0037] 其中，n代表每个标记的等位基因数，Pl代表第i个等位基因的频率。
[0038] k个标记的累积排除概率计算公式为：
[0039] CPE = l-d-PD (1_P2) (1_P3)…（l_Pk)
[0040] 在上述三种不同情况下，根据以上计算公式分别得出CPE(l)、CPE(2)、CPE(3)。 CPE(l)为第一种情况下的累积排除概率，即（1)当另一亲本信息未知时，排除子代与假设 亲本是亲子关系的排除概率：CPE(2)为第二种情况下的累积排除概率，即当另一亲本信息 已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率；CPE(3)为第三种情况下的累积排除 概率，即排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的排除概率，通过计算每个候选亲本在 所有检测位点排除概率，即可知道候选亲本为子代真实亲本的可能性大小，从而可对亲子 对之间的亲缘关系做出判断。
[0041] 本发明进一步提供所述微卫星标记在中国西门塔尔牛遗传改良育种中的应用。
[0042] 本发明针对中国西门塔尔牛牛群的特点，筛选出一组适用于检测西门塔尔牛亲子 关系的微卫星标记，共包括10个微卫星标记，这些标记多态性高、标记间不连锁且片段大 小间隔适当，易于同时检测。在三种不同情况下，利用此标记组合鉴定西门塔尔牛亲子关 系，累积排除概率 CPE(l)、CPE(2)、CPE(3)分别达 0. 9960969、0. 999854、0. 9999997,检测效 率极高。本发明利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术，通过优化实验体系，建立了基于上述 10个微卫星标记准确高效的基因分型方法。本发明的微卫星标记组合可用于中国西门塔尔 牛完整、准确的系谱鉴定，可提高中国西门塔尔牛育种准确性，加快其育种进程，具有良好 的应用前景和经济效益。
【附图说明】
[0043] 图1为本发明实施例1中以标记ETH225和CSSM66为例的微卫星基因型分型结果。
【具体实施方式】
[0044] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实 施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0045] 以下实施例中述及的实验牛群中国西门塔尔牛来自内蒙古乌拉盖地区445头中 国西门塔尔牛。
[0046] 实施例1中国西门塔尔牛亲子关系鉴定微卫星标记的筛选与确定
[0047] 1、微卫星标记位点的选择与分组
[0048] 根据文献研究相关报道，选择牛的14条不同染色体、多态信息含量较高的14个微 卫星基因座。选择的原则是：具有丰富的等位基因、高度多态性，位于不同染色体上，彼此之 间没有连锁关系，重复性好，无"哑等位基因（Null Allele)"等。详细信息见表4。
[0049] 表4 14个微卫星基因座基本信息
[0050]
[0052] 为降低微卫星基因分型的检测成本，根据微卫星标记的片段长度和所携带的荧光 基团将PCR产物混合分组。为避免同一组中出现非特异性条带干扰，每组中荧光颜色不同、 每个荧