一种利用多重皱纹盘鲍荧光标记微卫星进行家系识别和亲权鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋生物技术领域，具体的说是一种利用多重皱纹盘鲍荧光标记微卫 星进行家系识别和亲权鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino)是一类具有重要经济价值的软体动物， 因其肉质鲜美、营养丰富，早已成为我国重要的海水养殖对象之一。随着人民生活水平的不 断提高，皱纹盘鲍的需求量日益增大，因此各类遗传育种技术也相继在这个物种中开展起 来。建立优良性状比较稳定的家系是当前的主要任务之一，但由于皱纹盘鲍的生长周期较 长，养殖过程操作频繁导致繁育和培育过程中易受外源家系的污染，因此需要对养殖过程 的皱纹盘鲍个体进行亲权鉴定，明确各个个体的系谱关系。
[0003] 目前，国际上普遍认可微卫星标记，特别是多重微卫星PCR反应体系是解决该问 题的最优方案。可喜的是，在长牡蛎（Taris et al.，2005)、美洲牡蛎（Wang et al.，2010)、 亚洲鲈鱼（Zhu et al·，2010)、大西洋鲑鱼（Olafsson et al·，2010)等海洋水产动物中成 功构建了多重微卫星PCR体系，这些体系通过一组或少量几组PCR反应体系便可以高效、快 捷地进行亲权鉴定、系谱分析、遗传结构分析等研究。
[0004] 皱纹盘鲍微卫星多重PCR体系构建虽已见报道（聂鸿涛等，2013)，但该体系每个 组合仅有3个微卫星标记，且利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色，因此，效率 较低、易受主观影响。为提高工作效率，减少主观判断失误，从皱纹盘鲍遗传图谱18个连锁 群上挑选合适的微卫星标记，给各个微卫星标记标记不同的荧光基团，构建多重微卫星PCR 体系，可以高通量、低成本地来进行亲权关系的鉴定。该体系的建立也将使皱纹盘鲍的亲权 鉴定和系谱分析高速快捷，并对研究皱纹盘鲍遗传学数据分析更加标准化和规范化，利于 不同研究者之间的数据交流和共享。
【发明内容】
[0005] 本发明目的提供一种利用多重皱纹盘鲍荧光标记微卫星进行家系识别和亲权鉴 定的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 以标记荧光基团的皱纹盘鲍微卫星，采用多重PCR反应，进而高通量地用于皱纹 盘鲍不同家系的区分或者皱纹盘鲍亲权鉴定。
[0008] 将荧光基团标记于从皱纹盘鲍遗传图谱的连锁群上获得微卫星标记上，构建两组 多重微卫星PCR体系，得到的PCR样品利用ABI 3730x1全自动DNA测序仪进行微卫星分 型，ROX荧光分子作为内标，利用GeneMarker VI. 75软件获得微卫星分型数据，并根据微 卫星标记的孟德尔分离定律将数据通过PAPA (Package for the Analysis of Parental Allocation)软件，处理无效等位基因位点以及检测出可能存在的分型失误，进而高通量地 用于皱纹盘鲍不同家系的区分或者皱纹盘鲍亲权鉴定。
[0009] 所述两组标记荧光基团的皱纹盘鲍微卫星分别为：
[0010] 组合一为：
[0011] 皱纹盘鲍微卫星标记HD12
[0012] 正向引物（5, -3'）：FAM-TGGATCTGCTGTTTGTCAC，
[0013] 反向引物（5, -3'）：GGCTAATGTCCACTACTTTC ;
[0014] 皱纹盘鲍微卫星标记CHhl57
[0015] 正向引物（5, -3'）：FAM-ATAATAAACAGCATTGGCGGACG，
[0016] 反向引物（5, -3'）：CCACCCCTACTCCTAAATATTTTGG ;
[0017] 皱纹盘鲍微卫星标记CHhKM
[0018] 正向引物（5, -3,）：FAM-TGGCAATGTGGATTTTGTTGATG，
[0019] 反向引物（5, -3'）：GCTTCGATAAGCATTCTACATGGAG ;
[0020] 皱纹盘鲍微卫星标记CHhO 12
[0021] 正向引物（5, -3'）：HEX-GCAATCTAACCTATTCAGCCACC，
[0022] 反向引物（5' -3'）：GAACATAAGCAACATCACCATCA ;
[0023] 皱纹盘鲍微卫星标记Awb039
[0024] 正向引物（5, -3'）：HEX-TCGTTGTTCAAAGATAAAGATGTGA，
[0025] 反向引物（5 ' _3 '）： CTTACGTCCAGTGTTATGCGGTCTC ;
[0026] 皱纹盘鲍微卫星标记CHd533
[0027] 正向引物（5, -3'）：HEX-TCGTATCTCAGTAGGCTGGCAT，
[0028] 反向引物（5，-3，）： TTGTTCATTCTTGATTATTATCGTG ;
[0029] 皱纹盘鲍微卫星标记KHdh86
[0030] 正向引物（5, -3,）：TAM-AGTTGTTGAACCTTTCTGTTG，
[0031] 反向引物（5, -3'）：GAAAACTTCACCCACTACTTG ;
[0032] 皱纹盘鲍微卫星标记CHh 139
[0033] 正向引物（5, -3,）：TAM-TTTGCTAAAGCTGCGACATCGTATC，
[0034] 反向引物（5 ' -3 '）： CTTCTGTATTTCATGGTGTCCGTGG ;
[0035] 皱纹盘鲍微卫星标记CHhOOl
[0036] 正向引物（5, -3,）：TAM-GAAGCAAAACCAGATGCCAAGGAGG，
[0037] 反向引物（5 ' -3 '）： TTCAAGGTAGCAGCAACAGCAACGAC ;
[0038] 组合二为：
[0039] 皱纹盘鲍微卫星标记CHhO 11
[0040] 正向引物（5, -3,）：FAM-GATCTTTAITTGGCAAACTAA，
[0041] 反向引物（5 ' -3 '）： TGAAACCTGATACTGGTAAGC ;
[0042] 皱纹盘鲍微卫星标记Eab630
[0043] 正向引物（5, -3'）：FAM-GTACTTGTTGTTACCTTGGCATTC，
[0044] 反向引物（5, -3,）：ACGTAGACTTACGATAGTCATAGC ;
[0045] 皱纹盘鲍微卫星标记CHhl65
[0046] 正向引物（5, -3,）：FAM-CGTACCCCCTGTTGTGGTAGTAGAT，
[0047] 反向引物（5 ' -3 '）： TGTAGTGTTATACCAGTAGACGGCG ;
[0048] 皱纹盘鲍微卫星标记CHhl07
[0049] 正向引物（5, -3,）：HEX-GGTCCTCTGTGGTCTGAAGCAAC，
[0050] 反向引物（5，-3，）： TCAAGCATATCATACTTTGTACTACGCAC ;
[0051] 皱纹盘鲍微卫星标记CHh036
[0052] 正向引物（5, -3'）：HEX-GCTTAGTCAGACCTGAAGGATACC，
[0053] 反向引物（5, -3'）：GTTCTACTCACTGTAAAACAATCAATG ;
[0054] 皱纹盘鲍微卫星标记CHhl93
[0055] 正向引物（5, -3,）：HEX-TAACACCTGCGTCGTCTTCGTC，
[0056] 反向引物（5 ' -3 '）： TATCACAATTATTCCACAACCTTATGT ;
[0057] 皱纹盘鲍微卫星标记TrOOl
[0058] 正向引物（5, -3,）：TAM-ATGTGAATGCACGTCACTATG，
[0059] 反向引物（5, -3'）：ATAACTGTCTTAGCACTAGGATTG ;
[0060] 皱纹盘鲍微卫星标记CHh 170
[0061] 正向引物（5, -3'）：TAM-GGTATCCCAAAACATTTTCTGAGCA，
[0062] 反向引物（5, -3'）：GTTAGTGACCCCAAAAGTTCATCCA ;
[0063] 皱纹盘鲍微卫星标记CHh 175
[0064] 正向引物（5, -3'）：TAM-TTTACTGGATGTGAAACAGTGACAC，
[0065] 反向引物（5, -3'）：ATTGACTAGGAAGATGAGAAGCTGA。
[0066] 所述多重 PCR 反应条件为 Platinum? Taq DNA Master Mix (ABI) 7. 5ul, Primer Mix lul，GC Enchaner I. 5ul，模板 DNA(40_80ng/ul)lul，双蒸水补齐至 15ul。PCR 反应条 件为94°C变性4min，然后进行13个循环（94°C变性30s ;退火温度从59°C降至53°C，每I 个循环退火温度降低0. 5°C，退火时间为45s ;72°C延伸45s)，紧接着进行22个循环（94°C 变性30s ;53°C退火45s ;72°C延伸45s)，最后，72°C延伸10min，4°C保存。
[0067] 其具体步骤如下：
[0068] (1)提取皱纹盘鲍双亲与子代个体的基因组DNA ;
[0069] (2)根据皱纹盘鲍遗传连锁图谱18个连锁群中微卫星标记的扩增产物长度、反应 温度等特点，挑选出18个微卫星标记，标记三种荧光基团（分别为FAM、HEX和ΤΑΜ)。
[0070] (3)获得两组微卫星标记的特异性引物及标记荧光基团。
[0071] (4)优化皱纹盘鲍微卫星多重PCR反应条件。
[0072] (5)PCR产物利用ABI 3730x1全自动DNA测序仪进行微卫星分型，ROX荧光分子作 为内标。利用GeneMarker VI. 75软件对微卫星分型数据进行读取。
[0073] (6)根据微卫星标记的孟德尔分离定律，把数据输入到EXCEL中，利用软件中的宏 函