中国近海海马微卫星标记的特异性引物及鉴定方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于珍稀渔业资源调查领域，具体涉及一种中国近海海马微卫星标记的特 异性引物及鉴定方法。
【背景技术】：
[0002] 海马，属海龙科（Syngthidae)、海马属（Hippocampus)，为介类硬骨鱼，是一种名 贵海洋中药材，在我国素有"南方人参"之称，具有补肾壮阳、强心催产、止血镇痛、镇静安神 的功效，同时还很高的观赏价值和收藏装饰品的功能。海马的国际交易量也在逐年增多， 2009年仅我国进口海马干品已达4000万只，占国际海马市场的2/3,支付外汇5亿多美元。 在过去几十年中，由于长期过度捕捞、环境污染和气候变化等因素，我国海马种质资源受到 严重退化的威胁，有些海马种甚至到了灭绝的边缘。为了有效保护海马的种质资源，克氏海 马被列为国家二级保护动物，48种海马被列入《世界自然保护联盟》（IUCN) 2012年濒危动 物红色名录。
[0003] 为了对我国海马的野生资源实施有效的保护措施，准确的生物资源调查是第一 步，其中物种种类的鉴定是关键之处。传统的方法是基于海马形态学数据进行判定，然而这 种方法费时费力，更糟糕的是，当海马很小或者由于在海马标本的采集、加工、鉴定及储存 过程中可能被破坏时，无法从形态学上进行准确鉴定。随着分子标记的快速发展，利用微卫 星进行种类鉴定比较成熟，并且在多种动植物中得以应用。
【发明内容】
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[0004] 本发明的第一个目的是提供一种中国近海海马微卫星标记的特异性引物，其特征 在于，所述的中国近海海马微卫星标记的特异性引物如下所示：
【主权项】
1. 一种中国近海海马微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的中国近海海马微 卫星标记的特异性引物如下所示： 微卫星位点Tri-SSR-1特异性引物；F ;AGGAGCGAGCAAACAAGT R ；AGAGGGAATCTGATGAAGGTA 微卫星位点 Tri-SSR-2 特异性引物；F ;AGCAGTTCAGCAGCCATAG R；CCAGGTCCAATAATACAGCA 微卫星位点Tri-SSR-4特异性引物；F ;AAAGCCAGTTGCGGGAGC R ；GGACGCCGATGGGAGTGA 微卫星位点Tri-SSR-9特异性引物；F ;GGAGGCTTTGGTATGGAG R；GTCAAGGTGGAGAAGATGC 微卫星位点 Tri-SSR-15 特异性引物；F ;ATGCTGGGTTATTTTGGTGC R；TGCGGGTGACTTGCTGTG 微卫星位点Com-SSR-2特异性引物；F ;TGCCTTCATCCCTATCCT R；TATCACGCCATTCACCAG 微卫星位点Com-SSR-5特异性引物；F ;GCTGTCCTGACGATGCCT R；CCCTCCTCCCTTCTTTGC 微卫星位点 Com-SSR-6 特异性引物；F ;TGTGCTTTCTACTGTCTTCGTT R ；AATGAGTGTGTTGTCCCCTT 微卫星位点Com-SSR-7特异性引物；F ;TCTCATTCCTCGTCTTGC R；GGACTTTACGGGCTTCTA 微卫星位点 Com-SSR-8 特异性引物；F ;ATCTGATTATGAAGTCCTCCTC R ；TACCCCACCTACTGTCCG
2. -种中国近海海马微卫星标记的鉴定方法，其特征在于，包括W下步骤： (1) 、提取中国近海海马样品基因组DNA ; (2) 、W上述步骤（1)所提取的基因组DNA为模板，利用本发明的中国近海海马微卫星 标记的特异性引物对海马微卫星位点进行PCR扩增： (3) 、根据多个微卫星位点PCR扩增产物条带的"有/无"进行鉴定。
3. 根据权利要求2所述的中国近海海马微卫星标记的鉴定方法，其特征在于，在进行 步骤（2)时，使用阳性对照基因COI基因的引物对中国近海海马样品基因组DNA进行PCR 检测，引物序列；正向引物；5' -TCGACTAATCATAAAGATATCGGGAC-3'，反向引物；5' -ACTTCAGG GTGACCGAAGAATCAGAA-3'。
4. 根据权利要求2所述的中国近海海马微卫星标记的鉴定方法，其特征在于，步骤（2) 所述的PCR扩增，其扩增体系为；50ng基因组DNA，1XPCR缓冲液，1. 5mM Mg"，lUTaq酶， dNTPs 0. 2mM，中国近海海马微卫星标记的特异性引物的正反引物均为0. 25 uM。
5. 根据权利要求2所述的中国近海海马微卫星标记的鉴定方法，其特征在于，所述 的PCR扩增，其扩增程序为；95°C预变性5min ;95°C变性30s，按权利要求1所述的中国近 海海马微卫星标记的特异性引物的退火温度退火30s，72°C延伸45s，30个循环；72°C延伸 lOmin。
【专利摘要】本发明公开一种中国近海海马微卫星标记的特异性引物及鉴定方法。首先开发了多个海马微卫星标记(SSR)；然后提取海马样品DNA；再进行海马微卫星标记和阳性对照(COI基因)的PCR扩增；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据多个产物条带的带型“有/无”进行鉴定。本发明不受海马样品形态特征的限制，不管样品大或小、鲜活或死亡、是否变形、是否残缺，只需要少量DNA即可完成我国近海海马的物种鉴定，实用性强；结果一目了然、直观清楚、重复性强、可靠性高；可同时对多个或多种海马进行检测，操作简便、高效快捷，为促进我国近海海马的生物资源调查、种质保护和生态行为学等研究提供强有力工具。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104531870
【申请号】CN201410830238
【发明人】罗伟, 林强, 屈宏越, 王信
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月25日