鉴定香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的微卫星引物和鉴定方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于水产生物技术中的贝类分子标记和物种鉴定领域，具体涉及鉴定香港 巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的微卫星引物和鉴定方法。
【背景技术】：
[0002] 微卫星DNA，又称作短串连重复（STRs)、简单重复序列（SSRs)、简单序列长度多态 性(SSLP)，是指基因组中以1~6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。近年来，微卫星标 记以其简单高效等优点被广泛应用于物种鉴定和杂交种分析。
[0003] 牡蛎属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、牡蛎科，为全球性分布类群;牡蛎肉味鲜 美、富含多种人体必需氨基酸，是一种重要的海洋生物资源，更是世界上最重要的海水养殖 经济类群之一，其养殖总产量和单位面积产量在所有的贝类养殖种类中位居首位。牡蛎也 是中国产量最大的经济贝类，其中具有较高经济价值的香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎 在中国已进行人工养殖。香港巨牡(Crassostrea hongkongensis)喜欢生活在近河口或 附近有淡水注入的地方，主要分布在浙江、福建、广东、广西、海南，年产量在100多万吨。其 肉柱肥大、肉质白嫩、味道鲜美，市场价格远超过其它牡蛎品种。是暖温性近岸生长的一个 经济价值极高的牡类群，是我国南方养殖的主要经济种。有明牡_(Crassostrea ariakensis)在我国南北沿海均有分布，主要集中在广东、广西，分布于我国南北低盐海。其 肉味鲜美、营养丰富，是我国南方诸省的重要海水养殖经济贝类，已有近两百年的养殖历 史。太平洋牡(Crassostrea gigas)分布在我国长江以北，为世界性养殖品种，主要集中 在我国辽宁、山东等地，年产量近80万吨。由于生长速度快、环境适应性强、肉味鲜美，深受 广大消费者青睐。牡蛎的外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，单纯依靠形态 特征往往难以鉴别。而牡蛎软体部的解剖结构、染色体数目和核型差异很小，可提供的分类 证据也很少。近年来，基于C0I、16S rDNA等线粒体基因和ITS序列差异的分子生物学被用于 三者鉴定，但这些基因序列之间差异比较小，难以用电泳等简单方法进行区分;HRM方法虽 然简单，但需要相关大型仪器支撑;而测序试验周期较长，且花费较高。急需一种简单高效 的方法对香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎个体进行大规模物种鉴定。
[0004] 另外随着牡蛎养殖业对优良新品种需求的不断增加，种间杂交研究在牡蛎间不断 进行，学者们陆续开展了香港巨牡蛎X太平洋牡蛎、香港巨牡蛎X有明牡蛎、太平洋牡蛎X 有明牡蛎杂交组合的研究，并证明部分种间杂交牡蛎的精卵能够结合，并正常发育。对获得 的杂交后代进行遗传鉴定是很必要的，因为在牡蛎的种间杂交种经常会出现雌核发育、雄 核发育、单倍体等现象。急需一种简单方法对香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎的杂交个 体进行分子鉴定。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种简单、高效和精确的鉴定香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋 牡蛎及其杂交种的微卫星引物和鉴定方法。
[0006] 本发明从150对香港巨牡蛎微卫星引物中筛选出的1对微卫星（SSR)引物，用其对 香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎各90个个体的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可 以简单高效的进行物种鉴定，另外对三者间的杂交种个体鉴定也有潜在应用价值，从而实 现了本发明的目的。
[0007] 本发明的鉴定香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的微卫星引物，其特 征在于，所述的微卫星引物(SSR引物Ch409)为：
[0008] F:5'-CGACTGGTGGGAGITTCTGAC-3'（如SEQ ID N0.1 所示）；
[0009] R:5'-GCCGCTTCTATCTCCTTTGC-3'（如SEQ ID 恥.2所示）。
[0010] 本发明的香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的鉴定方法，其特征在 于，包括以下步骤：
[0011] 提取牡蛎样品的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，用上述微卫星引物进行PCR 扩增，PCR产物进行凝胶电泳，然后分型判定；
[0012]由于SSR引物Ch409产生的香港巨牡蛎特异条带范围在308bp~347bp之间，有明牡 特异性条带范围在362bp~422bp之间，太平洋牡特异性条带范围在206bp~242bp之 间，三者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分三种牡蛎的个体。如果PCR产物，若在 308bp~347bp区间内出现1~2条条带，则该牡蛎样品为香港巨牡蛎，出现1条条带说明该个 体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子;若在362bp~422bp区间内出现1~2条条 带，则该牡蛎样品为有明牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个 体为杂合子;若在206bp~242bp区间内出现1~2条条带，则该牡蛎样品为太平洋牡蛎，出现 1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子;如果PCR产物同时在 308bp~347bp区间和362bp~422bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带 的个体为香港巨牡蛎与有明牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种;如果 PCR产物同时在308bp~347bp区间和206bp~242bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的 1条特异性条带的个体才为香港巨牡蛎与太平洋牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条 带均为假杂种；如果PCR产物同时在362bp~422bp区间和206bp~242bp区间内各出现1条 带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体为有明牡蛎与太平洋牡蛎杂交子一代，缺少其 中的任意一个条带均为假杂种。
[0013]所述的以该基因组DNA作为模板，用上述微卫星引物进行PCR扩增优选PCR反应体 系为：DNA模板50ng，Buf f er 10mM，微卫星引物F和微卫星引物R各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+ 2 · OMm，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25yL;反应程序为:94。。预变性5min; 94。。变性30s， 60°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸 lOmin。
[0014] 本发明从150对香港巨牡蛎微卫星引物中筛选出一对能够在香港巨牡蛎、有明牡 蛎、太平洋牡蛎中通用并且可以根据扩增条带大小区分三种牡蛎，同时带型清晰、重复性 好、可靠性强的微卫星引物:Ch409,并在三者间的杂交种个体鉴定也有潜在应用价值。
[0015] 由于牡蛎的外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，单纯依靠形态特征 往往难以鉴别;幼体阶段的牡蛎根据形态特征更加难以区分。而利用本发明的微卫星引物， 采用本发明的鉴定方法，可以快速、准确地鉴定出香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎个体， 并且在三者间的杂交种个体鉴定中也具有潜在的应用价值，同时本发明具有方法简单、结 果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
【附图说明】：
[0016] 图1为微卫星引物Ch409在太平洋牡蛎、有明牡蛎、香港巨牡蛎部分个体间的电泳 染色对比图谱；1~9是太平洋牡蛎个体，其中2、3、4、5、6、7、8为杂合子，其他为纯合子，10~ 19是有明牡蛎个体，其中11、12、14、16、17、19为杂合子，其他为纯合子，20~29是香港巨牡 蛎个体，其中20、21、25、26、27、29为杂合子，其他为纯合子。
【具体实施方式】：
[0017] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018] 实施例1:
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