专利名称：一种利用est微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法，属于农业生物技术领域。
背景技术：
西花蓟马(Frankliniella occidentalis)是一种世界性入侵害虫。除对植物造成危害外，还传播多种植物病毒，给花卉、农作物造成严重损失。西花蓟马已广泛分布于美国、荷兰、日本等60多个国家和地区。在我国于2000年首次在云南省昆明国际花卉节参展的緬甸盆景上截获该虫，2003年在北京温室的辣椒上首次发现其危害，随后在云南、山东、江苏等地陆续被发现。西花蓟马与其他蓟马混合发生，若虫期形态相似，不易区分。有效区分西花蓟马是防治该虫的前期和基础，其对于西花蓟马的综合防控具有重要的理论意义和指导价值。EST来自转录区，其保守性较高，在家族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记更高，另外还具有开发简单、快捷、费用低等特点。EST微卫星标记已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传分化鉴定等方面。但利用EST微卫星标记构建区分西花蓟马的方法目前还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法。—种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物,所述引物为一对,分别为SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。正义引物EST-F:5，-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3，；SEQ ID N0.1反义引物EST-R:5’ -TGGATTTTCTTTACTTTGGT’ ；SEQ ID N0.2一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的方法，步骤如下:(I)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；(2)以步骤(I)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有234bp的一条条带时，则该被检测样品为西花蓟马；iPCR产物电泳图谱显示无234bp的条带时，则该被检测样品不是西花蓟马。所述步骤(2)中PCR扩增的扩增体系为:基因组DNA 溶液 2.5μ 1，20μΜ 引物 0.5μ l，5U/y I Taq 酶 0.25 μ 1，IOXTaqBuffer (缓冲液)2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 补至 25 μ I ；所述步骤( 2)中PCR扩增的扩增条件如下:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，进行35个循环；72°C延伸7分钟。上述步骤(I)中提取蓟马基因组DNA和步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京:科学出版社，2002)。有益效果1、本发明所述鉴别西花蓟马的引物能够扩增蓟马基因组DNA中的核基因，为鉴定西花蓟马与其他蓟马提供了简便稳定的分子标记，解决了区分西花蓟马的难题。2、本发明从分子水平探索了西花蓟马与其他蓟马EST序列的不同，探索建立了西花蓟马的鉴别技术，为今后西花蓟马的种群动态鉴定、生物学以及入侵机制的研究奠定了基础。
图1是实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中A、花蓟马，B、黄胸蓟马，C、棕榈蓟马，D、西花蓟马，M:DL2000DNA Marker。图2是实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中A、西花蓟马，B、花蓟马C、黄胸蓟马，D、棕榈蓟马，M:DL2000DNA Marker。图3是实施例3中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中A、花蓟马，B、黄胸蓟马，C、掠桐蓟马，D、西花蓟马，M:DL2000DNA Marker。
具体实施例方式下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。实施例1、2中所述蓟马于2011年采集于山东省济南市；按照(PC Brunner etal.,2002.A molecular identification key for economically important thripsspecies (Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-basedapproach.Agricultural and Forest Entomology, 4 (2): 127-136.)中记载的方法对上述蓟马进行检测，采集于山东省济南市的蓟马分别为花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、西花蓟马。实施例3中所述蓟马于2011年采集于山东省青岛市；按照(PC Brunner etal.,2002.A molecular identification key for economically important thripsspecies (Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-basedapproach.Agricultural and Forest Entomology, 4 (2): 127-136.)中记载的方法对上述蓟马进行检测，采集于山东省青岛市的蓟马分别为花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、西花蓟马。实施例所述TriS-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠均购自上海生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。实施例1(I)蓟马基因组DNA的提取将单头待鉴定样品置于含60 μ I碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为:50mmol.L^1Tris-HCl (ρΗ8.0)、20mmol.L-1NaCUlmmol.L-1EDTA (乙二胺四乙酸)、1%SDS(十二烷基硫酸钠)，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，制得基因组DNA溶液。(2)蓟马COI基因的PCR扩增以步骤(I)制得的基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；PCR扩增体系为:基因组DNA 溶液:3μ I ;20μΜ 引物:0.5μ I ;5υ/μ I Taq 酶:0.5μ I ;10XTaqBuffer:5 μ I ；10mM dNTP:1 μ I ；ddH20 补至 50 μ I ;引物序列如下:正义引物EST-F:5，-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3，；SEQ ID N0.1反义引物EST-R:5，-TGGATTTTCTTTACTTTGGT，；SEQ ID N0.2PCR扩增条件如下:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，进行35个循环；72°C延伸7分钟。(3)用2被％琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行检测。经多个待鉴定样品检测，只有西花蓟马检测出一长度在234bp的条带(如图1所示)，花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马中均未检测出长度在234bp条带，经检测，序列如SEQ ID N0.3所示。实施例2一种鉴别西花蓟马的方法，步骤如下:(I)将采集于山东省济南市的`单头蓟马个体置于含60μ I碱裂解液的0.2ml的离心管中，喊裂解液为:50mmol.L 1Tris-HCl (pH8.0)、20mmol.L 1NaCl、lmmol.L 1EDTA'1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，得基因组DNA溶液；(2)以步骤(I)制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的EST序列进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；PCR扩增体系为:基因组DNA 溶液 2μ 1，20μΜ 弓 I 物 0.5 μ l,5U/y ITaq 酶 0.25 μ 1，IOXTaqBuffer2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 补至 25 μ I ；引物序列如下:正义引物EST-F:5，-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3，；SEQ ID N0.1反义引物EST-R:5’ -TGGATTTTCTTTACTTTGGT’ ；SEQ ID N0.2PCR扩增条件如下:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，进行35个循环；72°C延伸7分钟。(3)用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离步骤(2)制得的酶切产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，成像胶片上有一条片段长度234bp的条带，该蓟马为西花蓟马；其他3种蓟马在成像胶片上均无234bp的条带，结果如图2所示。与按照(PC Brunner et al., 2002.A molecular identification key for economicallyimportant thrips species (Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong anda PCR-RFLP-based approach.Agricultural and Forest Entomology,4(2):127-136.)中记载的方法进行检测的结果一致。实施例3如实施例2所述的鉴别西花蓟马的方法，不同之处在于，所述蓟马于2011年采集于山东省青岛市。 结果显示，成像胶片上有一条片段长度234bp的条带，该蓟马为西花蓟马；其他3种蓟马在成像胶片上均无234bp的条带，结果如图3所示。与按照(PC Brunner etal.,2002.A molecular identification key for economically important thripsspecies (Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-basedapproach.Agricultural and Forest Entomology, 4 (2): 127-136.)中记载的方法进行检测的结果一致。·
权利要求
1.一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物，所述引物为一对，分别为SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
2.一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的方法，其特征在于，步骤如下 (1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液； (2)以步骤(I)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物； (3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有234bp的一条条带时，则该被检测样品为西花蓟马；iPCR产物电泳图谱显示无234bp的条带时，则该被检测样品不是西花蓟马。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增的扩增体系为 基因组 DNA 溶液 2. 5 μ 1，20 μ M 引物 O. 5 μ l,5U/y I Taq 酶 O. 25 μ 1，IOXTaq 缓冲液2· 5 μ 1，IOmM dNTPO. 5 μ 1，ddH20 补至 25 μ I ；
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增的扩增条件如下 ·94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，进行35个循环；·72 °C延伸7分钟。
全文摘要
本发明涉及一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法，步骤如下(1)提取蓟马基因组DNA；(2)以蓟马基因组DNA为模板对其进行PCR扩增；(3)对步骤(2)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明所述的鉴别方法，为筛选西花蓟马与其他3种蓟马提供了简便稳定的分子标记，为今后的西花蓟马的种群动态鉴定、生物学以及入侵机制的研究奠定了基础。
文档编号C12N15/11GK103255223SQ201310192769
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月22日 优先权日2013年5月22日
发明者褚栋, 陶云荔, 国栋 申请人:青岛农业大学