一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法
【专利摘要】本发明是一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法，包括缢蛏微卫星序列的查找，基因组DNA的快速提取，微卫星引物的适用性扩增和微卫星标记的基因型鉴定方法。首先，在缢蛏转录组数据库中，按照微卫星分类标准，快速查找微卫星序列；其次，利用简化的苯酚氯仿抽提法，快速提取DNA；然后，建立缢蛏微卫星引物适用性的PCR扩增方法；最后，采用FAM荧光标记引物和ABI3730核酸分析仪进行缢蛏微卫星标记的鉴定，建立了一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法。此方法具有高效、快速、准确等优点。
【专利说明】一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法。
【背景技术】
[0002]缢蛏是我国重要的滩涂贝类，其养殖历史悠久，是我国四大海产养殖贝类之一。由于缢蛏肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，其市场价值高，养殖前景非常广阔。目前，缢蛏的繁殖用亲贝主要来源于福建和浙江一带，长期以来容易导致苗种混杂，种质下降。采用分子标记检测缢蛏群体遗传多样性和亲缘关系，是了解缢蛏种质资源现状的主要方法。
[0003]由于微卫星标记具有分布广，多态性高，稳定性好等特点，在群体遗传学领域应用最为广泛。微卫星标记的开发是重要环节，目前主要有两种办法，一种是筛选其他物种已经开发的微卫星标记，但适用性差；另一种办法是在DNA水平上从头开发自身物种的微卫星标记，例如磁珠富集法和PCR法，但是这种办法费时费力。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于针对现有微卫星标记方法所存在的问题而提供一种在新一代测序技术构建缢蛏转录组数据库的基础上发明的既简单可行又准确可靠的快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法。
[0005]本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现:
[0006]一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法，包括以下步骤:`[0007]1.缢蛏微卫星序列的筛选步骤
[0008]利用新一代454测序技术获得缢蛏转录组数据库，按照两碱基重复次数>6，三碱基重复次数>4，四、五、六碱基重复次数>3的微卫星长度标准，利用SciRoKo软件在缢蛏转录组数据库所有序列中筛选缢蛏微卫星序列，利用Primerf软件在缢蛏微卫星序列的侧翼序列设计引物；
[0009]2.缢蛏基因组DNA的提取步骤
[0010]取0.2g缢蛏外套膜组织于裂解液中，利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，用
0.8%的琼脂糖胶电泳检测；
[0011]3.微卫星引物的适用性扩增步骤
[0012]采用上述DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶检测，于凝胶成像系统下观察并拍照记录；
[0013]4.缢蛏适用性微卫星标记的鉴定步骤
[0014]检测符合微卫星扩增效果的正向引物采用FAM荧光染料标记，之后进行PCR扩增，扩增产物采用ABI3730核酸分析仪检测，并利用GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析。[0015]在本发明的一个优选实施例中，所述步骤2)中，所述利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，具体如下:
[0016]A.取0.2g缢蛏外套膜组织，溶解于裂解液中，彻底裂解至澄清；
[0017]B.在裂解液中加入500uL苯酚，12000rpm离心20min ；
[0018]C.吸取上清液,加入500uL氯仿，12000rpm离心20min ；
[0019]D.吸取上清液,加入2倍体积预冷无水乙醇,静置30min, 12000rpm离心20min ；
[0020]E.弃掉上清液，将DNA溶解于IOOuL无菌水中，_20°C保存备用。
[0021]在本发明的一个优选实施例中，所述步骤3)和4)所述PCR扩增具体如下:
[0022]PCR反应体系为25μ L，含I ΧΜΙΧ，上、下游引物各0.2 μ mol/dm3，模板DNA20ng ；PCR反应条件:94 V预变性3min，( 94 V变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s )进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0023]本发明中微卫星序列的来源，不同于微卫星的从头开发技术，而是借助了高通量测序技术获得的转录组数据库，直接从数据库中查找微卫星序列，可以快速获得大量的微卫星序列；其次，本发明中DNA提取方案，在传统的苯酚氯仿抽提法，进行适当简化，节约了时间和成本，其提取结果可以用于后续微卫星引物的扩增。再次，本发明中微卫星的PCR扩增反应体系进行了简化，直接采用PCR扩增混合液(mix)，减少了加样步骤，尤其在进行大批量PCR扩增时，节约了大量时间；最后，本发明中微卫星的分型鉴定，不是采用传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，而是采用ABI3730核酸分析仪检测，精确度可达lbp，提高了准确性和精确性。
【具体实施方式】:
[0024]1.缢蛏微卫星序列的筛选
[0025]采集缢蛏外套膜，鳃，肝胰腺，水管，足和性腺6个组织，利用新一代454测序技术，获得缢蛏转录组数据库。按照两碱基重复次数>6，三碱基重复次数>4，四、五、六碱基重复次数>3的微卫星长度标准，利用SciRoKo软件在所有转录组序列中筛选微卫星序列。利用Primer3软件在微卫星侧翼序列设计引物。
[0026]2.缢蛏基因组DNA的提取。
[0027]取0.2g缢蛏外套膜组织，溶解于裂解液中，彻底裂解至澄清；在裂解液中加入500uL苯酹，12000rpm离心20min ;吸取上清液,加入500uL氯仿，12000rpm离心20min ;吸取上清液，加入1000uL预冷无水乙醇,静置30min, 12000rpm离心20min ;弃掉上清液，将DNA溶解于IOOuL无菌水中，用0.8%的琼脂糖胶电泳检测。
[0028]3.微卫星引物的适用性扩增
[0029]采用上述DNA作为模板，筛选适用的微卫星引物。PCR反应体系为20 μ L，含1ΧΜΙΧ，上、下游引物各0.2 μ mol/dm3，模板DNA20ng ；PCR反应条件:94 °C预变性3min，(94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s)进行30个循环，最后72°C延伸IOmin ;PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录。
[0030]4.缢蛏适用性微卫星标记的鉴定
[0031]将上述初步筛选适用的微卫星引物，将其正向引物进行FAM荧光染料标记，进行PCR扩增，扩增条件和反应体系同上，PCR反应产物采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper 软件(Applied Biosystems)进行基因型分析。
【权利要求】
1.一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤: 0.缢蛏微卫星序列的筛选步骤 利用新一代454测序技术获得缢蛏转录组数据库，按照两碱基重复次数>6，三碱基重复次数>4，四、五、六碱基重复次数>3的微卫星长度标准，利用SciRoKo软件在缢蛏转录组数据库所有序列中筛选缢蛏微卫星序列，利用Primerf软件在缢蛏微卫星序列的侧翼序列设计引物； 2).缢蛏基因组DNA的提取步骤 取0.2g缢蛏外套膜组织于裂解液中，利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，用0.8%的琼脂糖胶电泳检测； 3).微卫星引物的适用性扩增步骤 采用上述DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶检测，于凝胶成像系统下观察并拍照记录； 4).缢蛏适用性微卫星标记的鉴定步骤 检测符合微卫星扩增效果的正向引物采用FAM荧光染料标记，之后进行PCR扩增，扩增产物采用ABI3730核酸分析仪检测，并利用GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析。
2.如权利要求1所述的快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，具体如下: A.取0.2g缢蛏外套膜组织，溶解于裂解液中，彻底裂解至澄清； B.在裂解液中加入500uL苯酚，12000rpm离心20min； C.吸取上清液,加入500uL氯仿，12000rpm离心20min； D.吸取上清液，加入2倍体积预冷无水乙醇，静置30min，12000rpm离心20min； E.弃掉上清液，将DNA溶解于IOOuL无菌水中，_20°C保存备用。
3.如权利要求1所述的快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法，其特征在于，所述步骤3)和4)所述PCR扩增具体如下: PCR反应体系为25 4 1^，含1.MIX，上，下游引物各0.2 umol.dm ;PCR反应条件:94°C预变性3min，(94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s)进行30个循环，最后 72°C延伸 IOmin0
【文档编号】C12N15/10GK103509792SQ201310503959
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】牛东红, 李家乐, 谢淑媚, 王劦, 赵弘刚 申请人:上海海洋大学