控制玉米穗行数和穗粒数的dna片段、分子标记与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于玉米基因工程技术领域。具体涉及一种控制玉米穗行数和穗粒数的 DNA片段、分子标记与应用。所述的DNA片段，从玉米一种多效性QTLKRN4中克隆得到，位 于玉米第4染色体上。该QTL控制玉米果穗的穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产量等重要产量 性状。本发明公开了一个控制穗行数QTLKRN4的分离克隆、功能验证及应用，本发明还涉 及基于该QTL的分子标记开发与应用。
【背景技术】
[0002] 粮食安全一直是关系到国计民生的重大问题。玉米（ZeamayL.)是当今世界最 重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物，在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机 等方面作用巨大。与1990年相比，我国2010年玉米总产量增加了 1.83倍，但总产的增加 主要依赖于种植面积的增加，单产提高对总产增加的贡献约35%~40%。由于土地供给的 刚性制约，为满足我国国民经济持续发展对玉米的需求，提高玉米单位面积产量是遗传育 种学科的重大课题。
[0003] 玉米育种的理论和实践证明，自交系的产量与其杂交种的产量密切相关（Richey， 1946)。从上世纪30年代到90年代，美国玉米杂交种的产量逐步提高，伴随玉米杂交种产 量从1930S的5. 9吨/公顷增长到1980S的9. 1吨/公顷，自交系产量从2. 1吨/公顷增 长到4. 5吨/公顷；自1949至1996年期间，我国玉米产量增加8. 88倍，其中，播种面积增 长1. 25倍，而单位面积产量却提高了 3. 29倍。玉米产量的提高至少40 %的增产因素归 因于品种改良。在不同的种植密度下，杂交种产量与自交系产量平行增长的趋势是一致的 (Duvick，1999)，这说明自交系产量的改善对提高杂交种产量至关重要。在特定种植密度 下，单位面积的产量由玉米单穗籽粒产量与穗数组成，而单穗籽粒产量又由穗行数、行粒数 和百粒重组成。可见，产量是一个非常复杂的性状，直接对产量性状进行遗传分析是一个非 常复杂、困难的研宄课题，而将产量性状分解成各个产量组成因子分别研宄无疑是一个较 好的选择。穗行数是一个重要的产量组成因子，与产量显著正相关（刘纪麟，2000)，探明穗 行数形成的遗传机理有助于阐明玉米产量性状形成的遗传机理，也可为玉米产量性状的遗 传提供理论指导和新的基因资源。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供了一种控制玉米穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产量的多效 性QTLKRN4基因，根据KRN4位点中两个与穗行数显著关联的位点1. 2-KbPAV和S23,设 计基于PCR的经济便捷的分子标记引物，这些标记引物可用于玉米产量的遗传改良。其中 KRN4在近等基因系H21材料中的序列如SEQIDNO:l所示，KRN4在H21NX531(中国典型培养 物保藏中心，CCTCCNO.P201504)中的序列如SEQIDNO:2所示，S23在H21(来自国家农 作物种质保存中心）中的序列如3￡〇10勵：3所示，523在112严531中的序列如5￡〇10勵 ： 4所示，S23在玉米自交系W138(来自国家农作物种质保存中心）中的序列如SEQIDN0:5 所示。KRN4基因具有提高玉米穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产量的功能。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供了一种基于KRN4基因的分子标记引物，针对H21及 H21NX531KRN4序列差异，设计基因标记引物，通过分子标记辅助选择方法，能够准确快捷的区 分控制穗行数等性状等位基因型的优劣，即选择具有与H21NX531相同的等位基因型的自交系 作为优异的等位变异用于玉米的遗传改良。
[0006] 本发明的最后一个目的在于提供了一种控制玉米穗行数、穗粒数、轴粗及单穗产 量QTLKRN4基因及其分子标记引物在农作物增产中的应用，通过增加农作物穗行数、穗粒 数、轴粗，不降低百粒重，达到增产的目的。
[0007] 本发明的技术方案如下所述：
[0008] 本发明通过关联分析和图位克隆技术分离与玉米第4染色体4. 08bin控制玉米 穗行数、行粒数、穗粗及穗粒重的主效QTL KRN4,我们将这个基因命名为KRN4基因或QTL KRN4基因，并对该候选基因KRN4进行生物学验证，对KRN4基因的功能位点1. 2-Kb PAV和 S23开发出相关分子标记引物，用于鉴别优良KRN4等位基因型，同时进行分子标记辅助选 择用于玉米的遗传改良。
[0009]申请人提供了一种控制玉米穗行数和穗粒数的多效性QTL的制备方法，其步骤如 下所述：
[0010] 提取H21(来自国家农作物种质保存中心）及KRN4QTL近等基因系H21NX531(我们 将这个材料命名为玉米属玉米种ZeamaysL.玉米自交系H21-NX531，于2015年1月6日 送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCN0:P201504) 植株叶片总DNA，根据对KRN4精细定位获得的KRN4的3Kb的基因范围，利用玉米B73参考 基因组RefGen_v2设计引物扩展KRN4的引物KRMprimer，具体序列如下所示：
[0011]左端引物：5'AATGTAGCCCATAGTACACTCTATGA3'
[0012] 右端引物：5'AGTGGAGATAGAAAAGTTGCATTAGCCA3'
[0013] 另外，KRN4调控的基因ZmSBP30(GRMZM2G460544)启动子区的一个插入缺失S23和 穗行数显著关联，该zmSBP30p3-3标记引物具体序列如下：
[0014]左端引物：5'TTGTAGACGCCAGGTACTTGCGCTTGT3'
[0015]右端引物：5'GTCATGTATACCGITTGGITCTAGTG3'
[0016] 利用KRMprimer标记引物和zmSBP30p3-3标记引物PCR扩增玉米叶片DNAH21 和H21NX531，PCR扩增程序：94°C预变性5min，然后以94°C变性40s，55°C退火40s，72°C延伸 2min，进行35个循环，最后72°C延伸5min。扩增体系如表1 :
[0017] 表1玉米H21和H21NX531叶片DNA扩增体系
[0018]
【主权项】
1. 一个控制玉米穗行数的主效QTL KRM基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 如权利要求1所述的一个控制玉米穗行数的主效QTL KRM基因的等位基因，它们的 核苷酸序列分别如 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5 所示。
3. 权利要求1所述的主效QTL KRM基因在控制玉米穗行数、穗粒数、穗粗、轴粗和单穗 产量中的应用。
4. 如权利要求2所述的主效QTL KRM基因的等位基因在控制玉米穗行数、穗粒数、穗 粗、轴粗和单穗产量中的应用。
5. -种分离自玉米的分子标记引物组合M7,其DNA序列如下所示： 左端引物：TTAATACTTGCGTCATCTCTATTCTACG， 右端引物：ATCTCTAAGCACTCTTGCGCAAATCAAT。
6. -种分离自玉米的分子标记引物组合zmSBP30p3-3,其DNA序列如下所示： 左端引物：TTGTAGACGCCAGGTACTTGCGCTTGT， 右端引物：GTCATGTATACCGTTTGGTTCTAGTG。
7. 如权利要求5所述的分子标记引物组合M7在玉米标记辅助选择中的应用。
8. 如权利要求6所述的分子标记引物组合zmSBP30p3-3在玉米标记辅助选择中的应 用。
【专利摘要】本发明属于玉米基因工程领域，涉及一种控制玉米穗行数和穗粒数的DNA片段、分子标记与应用。得到一个控制玉米穗行数的主效QTL KRN4基因，其序列如SEQ ID NO：1所示。同时得到主效QTL KRN4基因的等位基因，它们的序列如SEQ ID NO：2-5所示。KRN4位点位于玉米第4染色体上，该位点控制玉米雌穗的穗行数和穗粒数等重要产量性状。通过相关试验证实KRN4通过影响下游ZmSBP30基因的表达，进而影响玉米穗行数、穗粒数、轴粗、单穗产量等产量性状，可明显增加玉米的行粒数和穗粒数，达到增产目的。还开发出相关的分子标记引物，可用于玉米的标记辅助选择。CCTCC NO： P20150420150106
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104651494
【申请号】CN201510021578
【发明人】张祖新, 刘磊, 杜艳芳, 申晓蒙, 李曼菲
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月15日